复合益生菌对肉鸡肠道微生物区系的影响

张利环，贾 浩，张若男，王燕飞，刘 璇

(山西农业大学生命科学学院，太谷 030801)

世界卫生组织将益生菌定义为在体内定植达到一定数量时可使机体受益的活性微生物[1]，其中干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌与双歧杆菌被统称为“健康三益菌”，常用作食品添加剂[2]。研究表明，益生菌可以增加肠道中的有益菌，调节肠道健康[3]。益生菌代谢还是刺激上皮细胞增殖和分化的能源，通过刺激肽和紧密连接蛋白的产生来发挥抗菌作用，维持肠道屏障内微生物稳态[4]。在集约化的肉鸡养殖中，肠道炎症是导致肉鸡生产性能下降甚至死亡的主要原因之一。肠道炎症会促进黏膜氧化应激，引起肠道微环境变化，导致有益细菌种类数量减少，而致病菌种类相对增多[5]。雏鸡肠道微生物的首要来源为蛋壳和饲料中的微生物群，刚孵化的雏鸡补充益生菌后，盲肠会被兼性需氧菌定植，这些细菌可消耗肠道内氧气且产生大量有机酸，导致肠道pH变低，从而抑制致病菌的生长和定植，改善肠道炎症[6-7]。研究表明，乳杆菌可增加肉鸡肠道中乳酸菌和双歧杆菌属等有益菌，减少大肠杆菌等致病菌，改善宿主的肠道微生物组成，降低死亡率[8-10]。Hong等[11]研究表明，补充2.0×1010CFU/g芽孢杆菌可增加厚壁菌门丰度，促进肉鸡生长。张李荣等[12]研究发现，雏鸡饲料中添加乳双歧杆菌后，可通过改善盲肠微生物的组成结构来提高生长性能。因此，可通过在雏鸡饮食中添加适量益生菌来调控雏鸡肠道微生物群的组成、降低致病菌的数量，改善其生长性能[13]。近年来研究显示，干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌对肉鸡生长有益，然而3种益生菌的混合物对肉鸡肠道微生物群的影响尚不清楚。因此，本研究将幼龄黄麻肉鸡作为研究对象，探讨复合益生菌对肉鸡生长性能及肠道微生物区系的影响，以期为复合益生菌在肉鸡生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与动物饲养

“健康三益菌”(干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌)冻干菌粉购自陕西瑞茂生物科技有限责任公司，按1∶1∶2的剂量比例配制成复合菌，有效活菌数>3.4×109CFU/g。将200只1日龄雄性黄麻肉鸡随机分为2组，每组5个重复，每个重复20只。复合菌制剂按1%比例补充于益生菌组肉鸡的饮用水中，以正常饮水的肉鸡为对照。基础饲粮组成及营养水平见表1。饲喂周期为42 d。

表1 基础饲粮组成及营养水平

肉仔鸡皆按规定接种疫苗，采用3层立笼式饲养于山西农业大学生命科学院动物房，每天上午08:00和下午20:00定时饲喂，鸡舍整洁且定期消毒，试验过程中鸡舍内保持24 h光照，确保肉鸡正常采食和饮水。室温从育雏第1周的33 ℃每日降低1 ℃，降至23℃结束。相对湿度第1周为65%～70%，之后降至60%左右保持不变。每天记录各组肉鸡的采食量。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 生产性能 饲喂结束前12 h，肉鸡停止进食，但可继续自由饮水，各组肉鸡以重复单位称取体重。根据试验期间的记录统计数据，计算肉鸡的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。每个处理取40只42日龄肉鸡屠宰，分别测定屠宰率和全净膛率。

1.2.2 肠道菌群高通量测序 断颈处死抽样鸡后解剖，无菌剪刀沿腹底部向上剖开腹腔，剪切下回肠与盲肠组织，使用无菌镊子分别从回肠与盲肠中挑取中心内容物于无菌离心管中(使用前用液氮预冻)，-80 ℃保存。

肠道内容物样本送至上海美吉生物医药科技有限公司在IlluminaMiSeqPE300系统上进行高通量测序。原始的测序序列通过fastp(v 0.19.6)软件进行质量过滤，通过FLASH(v 1.2.11)软件进行拼接。生成的序列通过USEARCH(v 7.0)软件根据97%的相似度进行操作分类单元(OTU)聚类，并识别和移除嵌合体序列。 利用RDP classifier(v 11.5)对每条序列进行物种分类注释，使用置信阈值为70%的QIIME2(v 2020.11)平台计算门-属水平上微生物群落的相对丰度。以观测到的OTU数为基础，利用QIIME2算法进行分类信息的注释，通过7个指数(包括Sobs、Chao、Shannon、Simpson、Shannoneven、Pd和Coverage)分析样本的物种丰富度、多样性、均一性与覆盖度，并利用QIIME2软件计算Beta多样性距离矩阵，基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)，在OTU水平上比较各样本微生物区系的组成，使用R语言(v 2.15.3)进行统计分析和作图。利用NetworkX软件进行网络分析，得到菌群在不同样本中的共存关系，凸显样本之间的相似性和差异性，采用线性判别分析(LDA)对各组差异菌群进行鉴定，以P<0.05和LDA=4用作LEfSe分析的阈值，并利用在线软件(http:∥huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload)进行非参数Wilcoxon秩和检验。使用PICRUSt(v 1.1.0)软件通过16S rDNA基因序列预测肠道菌群的功能组成概况，统计Level 3功能类别上的KEGG直系同源物。

1.3 统计分析

生产性能数据采用SPSS 24.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，高通量测序数据采用Wilcoxon秩和检验确定各处理间的差异。结果以平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 复合益生菌对肉鸡生产性能的影响

由表2可知，与对照组相比，益生菌组肉鸡的平均日增重显著增加(P<0.05)，平均日采食量、屠宰率和全净膛率增加，料重比降低，但差异均不显著(P>0.05)。

表2 各组肉鸡生产性能

2.2 肠道菌群的Alpha多样性

测序后通过高质量筛选和去除冗余序列，共获得1 303 882条高质量序列，分属于772个OTUs，459种，296属，160科，98目，41纲，18门。每个样本观测到的OTU数目的稀释曲线和Core分析均表明本次测序的测序量接近饱和，大部分多样性已产生，即使增加测序量也很少会有新物种出现(图1A、1B)。在回肠中，对照组的Sob、Chao、Shannon、Shannoneven、Pd和Simpson指数分别为154.00、196.51、2.06、0.41、16.54和0.28，益生菌组分别为123.38、171.70、1.43、0.29、12.21和0.44；在盲肠中，对照组分别为278.88、332.66、2.93、0.52、22.51和0.19，益生菌组分别为257.25、313.63、2.96、0.53、21.26和0.17。益生菌组较对照组肠道菌群多样性有降低趋势(P>0.05)。此外，盲肠的Sob、Chao、Shannon和Pd指数显著或极显著高于回肠(P<0.05；P<0.01)(图1C～1H)。所测样本的Coverage指数均高于0.99(图1I)，表明本次测序覆盖率高。

①A、B，分别为肠道微生物区系OTU水平的稀释与核心曲线；C～I，分别为肠道微生物区系OTU水平的Sob、Chao、Shannon、Simpson、Shannoneven、Pd与Coverage指数。②CI、CC、PI、PC，分别为对照组回肠、对照组盲肠、益生菌组回肠与益生菌组盲肠。③*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)。图7同

2.3 肠道微生物群落的组成结构

由图2A可知，在对照组回肠中，厚壁菌门(Firmicutes,92.69%)丰度最高，其次是放线菌门(Actinobacteriota,5.73%)；在盲肠中，厚壁菌门(Firmicutes,97.51%)丰度最高，其次是拟杆菌门(Bacteroidota,2.06%)。与对照组相比，益生菌组回肠厚壁菌门的丰度(98.55%)增加，放线菌门的丰度(0.74%)降低；盲肠厚壁菌门的丰度(98.27%)增加，拟杆菌门的丰度(1.41%)降低。说明厚壁菌门在肉鸡肠道菌群中具主体地位，复合益生菌可增加其丰度。

由图2B可知，在对照组回肠中，乳杆菌属(Lactobacillus,43.38%)、肠球菌属(Enterococcus,19.05%)、分节丝状菌属(Candidatus_Arthromitus,8.06%)、罗姆布茨菌属(Romboutsia,4.82%)、葡葡萄球菌属(Staphylococcus,4.77%)等为主要属；在盲肠中，罗姆布茨菌属(Romboutsia,28.54%)、未分类的毛螺菌科细菌(unclassified_f__Lachnospiraceae,20.64%)、布劳特氏菌属(Blautia,12.21%)、罕见小球菌属(Subdoligranulum,6.54%)等为主要属。与对照组相比，益生菌组回肠中未见梭菌属(Lachnoclostridium)，乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属和罗姆布茨菌属的丰度(8.41%、45.51%和13.09%)增加，肠球菌属、分节丝状菌属和葡葡萄球菌属的丰度(18.94%、0.60%和0.93%)降低；益生菌组盲肠中罗姆布茨菌属与罕见小球菌属的丰度(28.23%、5.06%)降低，未分类的毛螺菌科与布劳特氏菌属的丰度(26.71%、13.86%)增加。说明复合益生菌可降低肠道病原菌的丰度。

A、B，分别为在门和属水平上的肠道微生物组成，丰度<1%的类群被纳入“其他”类群

2.4 肠道微生物群落结构差异

由图3可知，对照组与益生菌组的回肠、盲肠的共有OTUs数分别为99和197，在对照组回肠、对照组盲肠、益生菌组回肠、益生菌组盲肠中独有OTUs数分别为127、42、10和14。益生菌组较对照组回肠、盲肠菌群的OTUs总数由469、488分别降低至327、466。共线性网络分析进一步发现，对照组与益生菌组回肠中各有3个独有的属，包括g_Gilliamella、迪茨氏菌属(Dietzia)、魏斯氏菌属(Weissella)与乳球菌属、鸡杆菌属(Gallibacterium)、g_unclassified_o__Lactobacillales；对照组与益生菌组盲肠中分别有9和5个独有的属，包括颤杆菌属(Oscillibacter)、g__Colidextribacter、g__Negativibacillus等与g_Anaerostipes、g__Butyricicoccus、g_Eisenbergiella、g__Tuzzerella等(图4)。

图3 肠道微生物的OTU数目Venn图

图4 细菌群落中50个最丰富属的共线性网络分析

由图5可知，第一主成分和第二主成分分别能解释对照组与益生菌组总差异的42.46%和12.63%。在ANOSIM分析中发现，R值为0.5705，P<0.001，表明本试验分组有意义，组间差异显著大于组内差异。

图5 OTU水平的PCoA分析

为确定各类群从门到属水平上的特化类群特征，使用LEfSe方法对样品中的所有有效序列进行分析，在回肠中，共富集了2门、1纲、2目、3科、4属(图6A)，放线菌门、布劳特氏菌属、葡萄球菌属、棒状杆菌属(Corynebacterium)在对照组回肠中富集，其中放线菌门的丰度最高；而厚壁菌门、乳球菌属在益生菌组回肠中富集，其中乳球菌属的丰度最高。在盲肠中，共富集了1目、2科、1属，其相对丰度均在对照组盲肠中富集，其中颤螺旋菌目的丰度最高(图6B)。

A、B，分别为对照组回肠与益生菌组回肠之间、对照组盲肠与益生菌组盲肠之间微生物类群和LDA得分的系统发育关系

使用Wilcox秩和检验评估LEfSe结果见图7。由图7可知，与对照组回肠相比，益生菌组回肠厚壁菌门、乳球菌属的丰度显著或极显著增加(P<0.05;P<0.01)，放线菌门、葡萄球菌属、布劳特氏菌属及棒状杆菌属的丰度显著或极显著降低(P<0.05;P<0.01)；与对照组盲肠相比，益生菌组盲肠DTU089的丰度显著降低(P<0.05)。

①A、B，门与属水平下的对照组与益生菌组回肠间物种丰度的差异；C，属水平下的对照组与益生菌组盲肠间物种丰度的差异。②X轴，某一物种在不同分组的平均相对丰度；Y轴，在特定分类级别下物种的名称。③*,差异显著(P<0.05);**,差异极显著(P<0.01)

2.5 肠道微生物功能预测

基于肉鸡肠道菌群COG代谢途径的丰度分析，利用PICRUSt工具将肉鸡肠道微生物划分为23个蛋白质数据库功能类群(图8)。其中E与G类(氨基酸和碳水化合物的运输和代谢)、J类(核糖体的结构和生物发生)、K与L类(复制、重组和修复)是肉鸡肠道的优势代谢功能。此外，统计分析表明，1个未知的功能S保持着最高的丰度。而基于肉鸡肠道菌群KEGG途径 (第3级) 的丰度分析表示，代谢途径、不同环境中的微生物代谢、次生代谢产物的生物合成、氨基酸的生物合成、ABC转运蛋白、碳代谢与核糖体途径的丰度在肉鸡肠道中显著富集(图9)。

图8 肉鸡肠道菌群COG代谢途径的丰度分析

图9 肉鸡肠道菌群KEGG(第3级)途径的丰度分析

3 讨 论

肠道菌群是体内最大、最复杂的微生态系统。多种共生微生物形成一个微生物屏障，保护肠道功能以调节能量代谢和吸收；微生物群介导的先天免疫防御可抑制侵入病原体的增殖，维持肠道免疫稳态[14]。宿主和肠道菌群在正常条件下处于动态平衡，若平衡被破坏则会导致各种疾病发生。Rehman等[15]研究表明，可以通过饮食因素如饲料添加剂来恢复和重建肠道复杂的微生物群，提高禽类的生长性能。生态学理论表明，肠道微生物物种的丰富性与微生态的稳定性有关。本研究表明，在42 d肉鸡肠道中，复合益生菌可使肠道微生物区系的Alpha多样性略为降低，这与Li等[16]研究结果一致，补充嗜酸乳杆菌可降低回肠微生物群的Shannon指数，恢复由坏死性肠炎破坏的肉鸡的微生物群落组成。益生菌降低微生物群的多样性指数可能是由于pH的降低为乳酸菌科这一优势菌群的增殖创造了良好的环境，限制了肠杆菌的生长[17]。 此外，本研究中对照组与益生菌组之间的细菌群落簇相互靠近，说明复合益生菌可以改善微生物群落结构，且影响较小。

肉鸡肠道有900种以上细菌，其中最丰富的是厚壁菌门、变形菌门与拟杆菌门[18]，本研究结果与其一致。健康动物的肠道与菌群之间通过和谐的相互作用来保持生物稳态，当菌群的成分或功能失调时，会导致肠道和肠道外疾病[19]。变形菌门细菌(如霍乱弧菌、大肠杆菌与沙门氏菌等)在肉鸡肠道定植会导致肠道感染。研究表明，乳杆菌复合菌可降低变形菌门数量并逆转沙门氏菌感染[20-21]。本研究表明，复合益生菌可提高肉鸡肠道内厚壁菌门的丰度，降低放线菌门、拟杆菌门与变形菌门的丰度，改善肠道健康。厚壁菌门和拟杆菌门作为肉鸡肠道中数量最多的两个门，两者的丰度之比(F/B)是衡量肠道菌群群落结构的重要指标。在体重较高和料重比较低的肉鸡粪便中F/B增加[22]。本研究中，复合益生菌影响肠道菌群的组成结构，可通过增加肠道内F/B来促进肉鸡体重的增加，提高肉鸡的生长性能。Chen等[23]研究表明，膳食中补充芽孢杆菌发酵产品也有类似效应，可改变能量收集、脂质代谢及内分泌功能，影响宿主代谢。 F/B的增加与肥胖有关，主要是由于厚壁菌门细菌获取能量的能力较高[24]。

毛螺菌科和消化链球菌科家族是一种厌氧、芽孢形成的细菌，可以降解淀粉和非淀粉多糖，将复杂的多糖转化为短链脂肪酸[25-26]。由于家禽体内缺乏消化非淀粉多糖的内源性酶，因此限制了高纤维含量饲料的利用，而在本试验中，盲肠毛螺菌科的丰度增加，表明复合益生菌可增加盲肠发酵降解非淀粉多糖的能力，提高饲料利用率。梭菌属细菌可引起肠道感染，如常见的弯曲杆菌病，会引起血液炎症，导致腹泻、痉挛和疼痛等[27]，而乳酸菌是肉鸡消化道的优势细菌之一，可以产生挥发性脂肪酸和抗菌因子，限制肠道病原体的增殖，预防肠道感染和腹泻。Lin等[28]研究表明，膳食中补充地衣芽孢杆菌发酵产品可抑制金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌的生长，缓解肉鸡坏死性肠炎，改善生长性能。Hossain等[29]和刘凤美等[30]也指出，复合益生菌会引起肠道中乳酸杆菌增加，梭状芽孢杆菌和大肠杆菌减少。本研究中也有相同的结论，复合益生菌可使回肠产生特有的乳球菌属细菌，增加了乳杆菌属的丰度，同时降低梭菌属、肠球菌与葡萄球菌属的丰度，改善肠道健康。益生菌可产生抗菌性环状脂肽，通过破坏细菌膜来表现其抗病活性，益生菌这种衍生表面活性素的抗菌机制可能会导致肉鸡形成独特的微生物组[31]。综上，复合益生菌可增加乳酸杆菌种类，降低病原菌的生存能力，改善肠道细菌平衡，还可通过促进黏蛋白的产生来增强黏膜屏障，从而稳定肠道菌群。盲肠是各种复杂微生物群的理想栖息地，在肉鸡整个肠道中具有最丰富的代谢功能，而糖类运输途径的丰度富集在回肠。本研究中复合益生菌可调节肠道菌群的组成，但不会影响肠道多种代谢功能。

4 结 论

复合益生菌可通过增加肉鸡回肠乳杆菌属丰度、降低病原菌丰度来改善肠道菌群的组成、功能和多样性；同时通过增加盲肠毛螺菌科丰度来提高盲肠发酵降解非淀粉多糖的能力，进而提高饲料利用效率，促进肉鸡生长。