表达禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白的重组耐热新城疫病毒的构建及免疫效果评估

商 雨，李林涛，李 丽，徐英英，冯贺龙，汪宏才，张蓉蓉，曾 哲，王红琳，罗青平，邵华斌，温国元

(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，畜禽病原微生物学湖北重点实验室，武汉 430064)

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)是一种世界范围内流行的、家禽和野禽常发的传染病病原。FAdV属于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属(Aviadenovirus)成员，可划分为5个病毒种群(FAdV-A～FAdV-E)[1]。禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4 type,FAdV-4)属于FAdV-C种群，主要引起禽类的肝脏发生病变，以包涵体肝炎和心包积水-肝炎综合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)为主[2-3]。FAdV-4引起的疫病一旦暴发，致死率可达30%～70%，给养禽业带来重大损失[4-7]。2015年之前，该病在中国呈零星暴发的状态；2015年，该病在山东暴发之后，迅速蔓延至中国其他省份[8-11]。

FAdV-4含有10种结构蛋白，其中五邻体蛋白(penton protein)、六邻体蛋白(hexon protein)和纤突蛋白(fiber protein)是主要的结构蛋白。FAdV-C种病毒粒子上，每个五邻体蛋白有2种长度接近的纤突蛋白Fiber1和Fiber2，且这2种Fiber蛋白有不同的特性[12]。Wang等[13]研究结果表明，FAdV-4的Fiber1蛋白可通过其Shaft和Knob结构域介导病毒感染宿主细胞，而Fiber2却不具备相应的功能。Fiber2蛋白和Hexon蛋白与FAdV-4的致病性有密切关系[14-15]，而Fiber1和Penton蛋白对病毒的毒力无直接影响[16]。Fiber、Penton和Hexon蛋白均可诱导机体产生中和抗体，Wang等[17]比较了这几种蛋白的免疫效果，结果表明Fiber2蛋白的免疫保护效果最好，其次是Fiber1和Penton蛋白。因此，Fiber2蛋白被广泛用于开发抗FAdV-4的诊断试剂、亚单位疫苗和基因工程疫苗的研究[18-22]。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株引起的鸡急性、高致死性和高传染性的疫病。在中国，新城疫属于国家全面免疫的动物疫病之一，新城疫疫苗分为2类：活疫苗和灭活疫苗。NDV LaSota株疫苗以其毒力低、免疫原性好和免疫保护率高，深受广大养殖户的青睐[23]。

随着反向遗传学技术在RNA病毒研究和应用领域的快速发展，为NDV研究和开发多价基因工程疫苗提供了平台。本研究利用NDV LaSota株作为载体，利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株TS09-C株的HN基因替换到LaSota株基因组上，并将FAdV-4 的Fiber2基因插入到LaSota株基因组上，构建表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV rTS-HN-Fiber2，评估NDV rTS-HN-Fiber2的免疫效果和保护效果，以期为开发控制NDV和FAdV的二价耐热基因工程疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司(SPF鸡胚在孵化期内孵化9～10 d，取健康鸡胚用于试验；SPF雏鸡为SPF鸡胚经孵化后，在隔离器内培养至7日龄)。

1.1.2 细胞、病毒和载体 BHK-21细胞、NDV TS09-C耐热株、LaSota株和FAdV-4强毒株HB1510均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室保存，细胞用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，病毒经9～10日龄SPF鸡胚进行增殖；表达T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒、NDV LaSota株的cDNA克隆质粒pLaSota和辅助质粒pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室构建；大肠杆菌Stabl2感受态细胞购自Invitrogen公司。

1.1.3 主要试剂 PCR酶(2×PrimeSTAR Max Premix)、核酸酶DpnⅠ和In-Fusion连接酶(In-Fusion Snap Assembly Master Mix)均购自宝生物工程(大连)有限公司；反转录试剂盒(HiscriptⅡqRT SuperMixⅡ)和T4 DNA连接酶均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒均购自Omega公司；病毒基因组提取试剂盒(Axyprep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit)购自Axygen公司；无内毒素质粒提取试剂盒(QIAGEN®Endo-free Plasmid Mini Kit)购自上海北诺生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)和DMEM培养基均购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司；鸡抗NDV多克隆抗体、鼠抗FAdV多克隆抗体和LB细菌培养基均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室制备；Alexa Fluor 555标记的抗鸡IgY单克隆抗体和FITC标记的抗鼠IgG单克隆抗体均购自武汉爱博泰克(ABclonal)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NDV TS09-C株cDNA制备和FAdV-4基因组提取 取200 μL NDV TS09-C株病毒尿囊液，按照病毒基因组提取试剂盒说明书提取病毒RNA，提取的RNA用30 μL无RNA酶水洗脱，再按照反转录试剂盒说明书步骤，将25 μL RNA反转录成cDNA，-80 ℃保存备用。 取200 μL FAdV-4培养物，按照病毒基因组提取试剂盒说明书提取病毒基因组DNA，提取的DNA溶解于30 μL无RNA酶水中，-80 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计及合成 参照FAdV-4 HB1510株(GenBank登录号：KU587519.1)、NDV LaSota株(GenBank登录号：KC844235.1)和NDV TS09-C株(GenBank登录号：JX110635.1)的序列信息，用Primer Premier 5.0软件设计病毒改造和外源基因插入的引物,引物信息见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.3 NDV LaSota株的耐热改造 以NDV LaSota株的cDNA克隆质粒pLaSota为模板，用引物pLaSota-F和pLaSota-R扩增除HN基因以外的片段，扩增完成后用核酸酶DpnⅠ消化cDNA模板。以NDV TS09-C耐热株基因组cDNA为模板，用引物TS/HN-F和TS/HN-R扩增TS09-C株HN基因。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。利用In-Fusion体外连接试剂盒连接2个回收的目的片段，连接产物转化大肠杆菌Stabl2感受态细胞。转化产物涂布LB平板，37 ℃培养12～16 h，挑选单菌落在LB液体培养基中培养。通过菌液PCR扩增HN基因并提取质粒进行测序鉴定，将构建正确的质粒命名为pTS-HN。质粒构建示意图见图1。

1.2.4 重组NDV的构建 以pTS-HN质粒为模板，用引物pTS/HN-F和pTS/HN-R扩增质粒全长，扩增的起点为P和M基因的间隔区，扩增完成后用核酸酶DpnⅠ消化pTS-HN质粒模板。以FAdV-4基因组DNA为模板，用引物Fiber2-F和Fiber2-R扩增Fiber2基因，通过引物在Fiber2基因序列上加上NDV基因起始序列(gene start,GS)、基因终止序列(gene end,GE)和Kozak序列(图1)。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。利用In-Fusion体外连接试剂盒连接2个回收的目的片段，连接产物转化大肠杆菌Stabl2感受态细胞。转化产物涂布LB平板，37 ℃培养12～16 h，挑选单菌落在LB液体培养基中培养。通过菌液PCR扩增Fiber2基因并提取质粒进行测序鉴定，将构建正确的质粒命名为pTS-HN-Fiber2。

图1 NDV LaSota株耐热改造和外源基因插入策略

1.2.5 重组NDV的拯救 将生长状态良好的BHK-21细胞传代至6孔板中，待细胞生长至汇合度为80%～90%时，用表达T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒感染BHK-21细胞，感染复数(multiple of infection,MOI)为0.01。 感染2 h后，分别将pTS-HN和pTS-HN-Fiber2质粒与3个辅助质粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)共转染BHK-21细胞；转染4～6 h后，将细胞培养液更换为维持液；继续培养96～120 h，收集培养上清，用0.22 μm滤器过滤；再接种于9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔，培养4～5 d，收集病毒鸡胚尿囊液。按照核酸抽提试剂盒说明书抽提尿囊液病毒基因组RNA，用RT-PCR方法检测目的片段并进行测序，确定重组NDV构建正确。鉴定正确的重组NDV依次命名为rTS-HN和rTS-HN-Fiber2。 获得重组NDV后，在鸡胚上连续传3代，获得高滴度的病毒。

1.2.6 重组NDV的生物学特性测定 测定LaSota、rTS-HN和rTS-HN-Fiber2株病毒尿囊液的血凝(hemagglutination assay,HA)效价、鸡胚半数感染剂量(embryonate median infective dose,EID50)、半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID50)、鸡胚平均致死时间(mean death time,MDT)和脑内致病指数(intracerebral pathogenicity index，ICPI)。

1.2.7 重组NDV生长曲线的测定 重组NDV的生长曲线测定试验中，分别将LaSota、rTS-HN和rTS-HN-Fiber2毒株以MOI为5的剂量接种至已长为致密单层的BHK-21细胞，孵育1 h后弃去上清，PBS洗涤3遍，分别取感染后12、24、48、72、96 h的培养液上清，进行病毒滴度测定。根据测得的病毒滴度和相应的培养时间点，得出重组NDV耐热株的细胞生长曲线。

1.2.8 重组NDV热稳定性试验 重组NDV的热稳定性试验中，将TS09-C、LaSota、rTS-HN或rTS-HN-Fiber2置于56 ℃水浴锅中进行热处理，分别于5、10和15 min取出病毒液样品，在细胞上测定各处理病毒液的滴度。根据滴度和热处理时间绘制病毒的热稳定趋势图。

1.2.9 Fiber2蛋白表达鉴定 在6孔板中，分别用LaSota、rTS-HN和rTS-HN-Fiber2感染汇合度为80%～90%的BHK-21细胞，MOI为1。 于37 ℃孵育1 h后，更换为含0.2 μg/mL TPCK胰酶的无血清DMEM培养基。继续在37 ℃培养，72 h时用间接免疫荧光试验(IFA)检测NDV蛋白和FAdV-4 Fiber2蛋白的表达。分别用鸡抗NDV多克隆抗体和鼠抗FAdV多克隆抗体为一抗，用Alexa Fluor 555标记的抗鸡IgY单克隆抗体和FITC标记的抗鼠IgG单克隆抗体为二抗。于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.10 重组NDV免疫试验 将7日龄SPF雏鸡分为4组，每组12只，第1组免疫rTS-HN-Fiber2；第2组免疫rTS-HN；第3组为阳性对照组；第4组为阴性对照组。 第1、2组免疫剂量均为107EID50，免疫方式为滴鼻点眼，第3、4组通过滴鼻点眼的方式免疫同体积的PBS。首免后2周，用同样的方式和免疫剂量进行一次加强免疫。在首免和加强免疫1周后，对各组鸡群进行采血，分离血清。用血凝抑制试验(hemagglutination inhibition,HI)测定血清中NDV抗体的滴度。

1.2.11 FAdV-4攻毒试验 在加强免疫后2周，第1～3组进行FAdV-4强毒株的攻毒试验，攻毒剂量为104LD50/羽，第4组作为阴性对照组。攻毒后，每天观察鸡的状态，记录死亡情况，并绘制存活曲线。FAdV-4强毒株攻毒5 d后，随机剖杀3只各组未死亡鸡，取心脏、肝脏和肾脏组织，各取部分组织用4%甲醛溶液进行固定，另一部分提取组织DNA。固定的组织制作切片，HE染色，镜下观察，评估不同组织的病理变化程度；用实时荧光定量RT-PCR测定组织中FAdV-4 DNA的载量。

1.2.12 统计分析 利用SPSS 16.0软件中的Studentt检验对各组血液中抗体滴度和组织中病毒滴度进行统计分析,结果用平均值±标准差表示,P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 重组NDV构建及拯救

2.1.1 重组质粒pTS-HN的鉴定 分别以TS09-C株cDNA和pLaSota质粒为模板，通过PCR扩增获得1 851 bp 的TS09-C株的HN基因片段(图2A)及LaSota株全长cDNA克隆中除HN基因以外的16 592 bp序列片段(图2B)。利用In-Fusion试剂盒将2个片段进行重组形成重组质粒，经大肠杆菌Stabl2感受态细胞增殖，PCR检测结果显示插入片段大小为1 851 bp(图2C)，与预期大小相符，测定结果表明重组质粒中的HN基因与TS09-C株的HN基因完全一致，重组LaSota质粒pTS-HN构建成功。

①A，TS09-C HN基因PCR扩增；B，pLaSota质粒PCR扩增；C，pTS-HN质粒PCR鉴定。②1,HN基因；M1，DL2000 DNA Marker；2、3，pLaSota质粒；M2，DL15000 DNA Marker；4～6，3个单克隆菌株；+，阳性对照；-，阴性对照

2.1.2 重组质粒pTS-HN-Fiber2的鉴定 分别以FAdV-4基因组DNA和pTS-HN质粒为模板，通过PCR扩增获得大小为1 470 bp的Fiber2基因片段(图3A)和18 443 bp的线性化pTS-HN片段(图3B)。利用In-Fusion试剂盒将2个片段进行重组形成重组质粒，经大肠杆菌Stabl2感受态细胞增殖，PCR检测可获得大小为1 470 bp的插入片段(图3C)，测定结果表明重组质粒中的Fiber2基因序列与预期完全一致，基因两侧的GS、GE和Kozak序列构建也是正确的，重组LaSota质粒pTS-HN-Fiber2构建成功。

①A，FAdV-4 Fiber2基因扩增；B，pTS-HN质粒扩增；C,pTS-HN-Fiber2质粒鉴定。②1、2，Fiber2基因；M1，DL5000 DNA Marker；3、4，pTS-HN质粒；M2，DL15000 DNA Marker；M3，DL2000 DNA Marker；-，阴性对照；+，阳性对照；5、6，2个单克隆菌株

2.1.3 重组NDV的拯救 病毒拯救结果表明，第1代鸡胚尿囊液的HA滴度在1∶22至1∶25范围内。提取病毒基因组RNA进行RT-PCR检测，扩增HN基因和Fiber2基因进行测序分析，结果显示序列均与预期相符。

2.2 重组NDV生物学特性的测定

病毒滴度测定结果显示，rTS-HN-Fiber2、rTS-HN和LaSota血凝效价分别可达到1∶211、1∶210和1∶210；在鸡胚上的增殖滴度可分别达到108.62、108.53和109.17EID50/mL，细胞培养物中病毒滴度分别为107.50、106.62和107.94TCID50/mL,3株重组NDV的MDT均>120 h，ICPI均为0(表2)。

表2 重组NDV滴度和毒力测定

2.3 重组NDV的生长曲线

在BHK-21细胞上测定重组NDV的生长曲线，结果表明LaSota、rTS-HN和rTS-HN-Fiber2有相似的生长曲线，3株病毒在感染72 h后达到平台期，但LaSota增殖滴度最高，rTS-HN-Fiber2病毒的滴度略低于rTS-HN和LaSota(图4)。

图4 重组NDV的生长曲线

2.4 重组NDV的热稳定性

热稳定性试验结果显示，LaSota的热稳定性最差，在56 ℃处理5 min时，病毒滴度下降超过107TCID50/mL； rTS-HN和rTS-HN-Fiber2在56 ℃处理15 min后，滴度下降约103TCID50/mL；而同样在56 ℃处理15 min条件下，TS09-C株病毒的滴度下降约102TCID50/mL(图5)。

图5 重组NDV的热稳定性试验

2.5 Fiber2蛋白表达鉴定

利用IFA检测NDV蛋白和Fiber2蛋白在细胞内的表达情况，结果显示，在LaSota、rTS-HN和rTS-HN-Fiber2病毒感染的BHK-21细胞内能检测到NDV蛋白的表达；在rTS-HN-Fiber2病毒感染的BHK-21细胞内能检测到Fiber2蛋白的表达(图6)。

图6 IFA检测重组NDV的蛋白表达情况(100×)

2.6 重组NDV免疫试验结果

分别在首免和加强免疫1周后测定鸡群抗体水平，结果见图7。由图7可知，rTS-HN和rTS-HN-Fiber2免疫组NDV抗体血凝抑制效价均达到1∶24以上，极显著高于阴性对照组(P<0.01),加强免疫与首免后1周相比，各组NDV的抗体水平均无显著差异(P>0.05)；且rTS-HN组与rTS-HN-Fiber2组的抗体水平差异不显著(P>0.05)。

*,差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)；ns，差异不显著(P>0.05)。下同

2.7 FAdV-4攻毒试验结果

组织FAdV载量测定结果显示，rTS-HN免疫组与阳性对照组各组织病毒载量差异不显著(P>0.05)，而rTS-HN-Fiber2免疫组，各组织中病毒载量均极显著低于阳性对照组(P<0.01)(图8A)。各组雏鸡在攻毒后的存活曲线显示，rTS-HN-Fiber2免疫组的存活率为100%，而阳性对照组和rTS-HN免疫组的存活率仅为66.7%(图8B)。rTS-HN免疫组心肌出血，肝细胞变性坏死和淋巴细胞浸润；rTS-HN-Fiber2免疫组只有肝脏组织中少量的淋巴细胞浸润；阳性对照组出现严重的淋巴细胞浸润相关的心肌炎，肝脏组织大量的淋巴细胞浸润，肝细胞变性坏死(图9)。

图8 FAdV-4强毒株攻毒后组织病毒载量(A)和存活曲线(B)

图9 FAdV-4强毒株攻毒后雏鸡组织病理变化

3 讨 论

由FAdV-4和NDV感染引发的疫情给世界范围内的养禽业带来了严重危害，开发安全高效的FAdV疫苗是疫情防控的关键。本研究构建表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组弱毒NDV，可作为疫苗研发的候选毒株，可实现NDV和FAdV的同步免疫，达到降低生产成本及省工省时的效果。

FAdV 3种结构蛋白Penton、Hexon和Fiber均具有免疫原性，免疫动物后均能产生中和抗体，但以Fiber2蛋白的免疫效果最佳[17]。本研究选择Fiber2全长蛋白为研究对象，构建表达Fiber2蛋白的重组NDV。NDV LaSota株因其弱毒力和高免疫原性的特性被广泛应用于防控新城疫灭活疫苗和活疫苗的开发[24]。Tian等[18]研究表明,利用表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组NDV LaSota株免疫雏鸡可使雏鸡抵抗FAdV-4强毒的攻击,证明了以LaSota株为载体，构建针对FAdV-4和NDV的二联疫苗的可行性。NDV LaSota株对热非常敏感，56 ℃处理5 min就能丧失活性；常温下，病毒的感染性也下降得非常快。因此，以LaSota株为基础开发出来的基因工程活疫苗在应用的过程中最大的弊端是对冷链的要求很高，不利于炎热地区和偏远地区的推广使用。部分NDV毒株(如V4、TS09-C和I2等)具有很好的热稳定性，且研究表明，NDV热稳定性的主要决定因子是HN蛋白[25]。本研究在构建过程中进行了改进，用NDV TS09-C耐热株的HN基因替换掉LaSota株的HN基因，以增强重组病毒的热稳定性，这将有利于后期开发重组基因工程疫苗。

生物学特性测定结果表明,重组NDV rTS-HN和rTS-HN-Fiber2保持了LaSota株的无致病性及TS09-C株的热稳定性。在生长曲线上rTS-HN-Fiber2的病毒滴度比rTS-HN和LaSota低，可能是因为插入Fiber2基因后使得基因组长度增大，NDV基因组复制和基因转录的效率都会因此降低，导致病毒复制略慢。免疫和攻毒试验结果表明，重组NDV rTS-HN-Fiber2免疫动物能产生针对NDV的抗体，且能抵抗FAdV-4致死剂量的攻击。免疫雏鸡在攻毒后的组织病变明显减轻,组织病毒载量显著减少。以上结果证实以NDV LaSota株为载体，开发NDV-FAdV-4二联耐热活疫苗具有良好的可行性和应用前景。

因为NDV LaSota株和TS09-C株均属于基因Ⅱ型，而目前流行的高致病性NDV以基因Ⅶ为主，抗体的交叉保护效果不高，因此该疫苗候选株依旧有改进的空间。另外NDV LaSota株广泛应用于养殖场免疫，初生雏鸡体内的母源抗体水平较高，使得活疫苗免疫效果较差，因此,以NDV为载体的基因工程疫苗需提升疫苗抵抗母源抗体干扰的能力。有研究用致弱的基因Ⅶ强毒为载体表达FAdV-4 Fiber2蛋白，免疫动物后可很好地抵抗NDV基因Ⅶ强毒和FAdV-4强毒的攻击[26]。但该疫苗的潜在威胁是在使用过程中可能出现毒力返强。利用本研究构建的重组弱毒耐热病毒进行抗原修饰或部分基因Ⅶ抗原的替换，在达到较好的免疫效果同时又可避免母源抗体对病毒的中和反应。

4 结 论

本研究构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV rTS-HN-Fiber2株，其具有亲本株LaSota的增殖特性和毒力，且热稳定性显著提升。用rTS-HN-Fiber2免疫雏鸡可产生NDV的中和抗体，并可提升抵抗FAdV-4强毒攻击的水平，降低组织内病毒载量和减轻病理损伤。该重组NDV可作为疫苗候选株，用于开发NDV和FAdV的二价基因工程疫苗。