抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

王乐铭，王瑜瑞，曾子轩，饶国顺，吴正姣，靳纬坤，王冬英

(广西大学动物科学技术学院，南宁 530004)

大片形吸虫(Fasciolagigantica，Fg)是片形吸虫病(fascioliasis)的病原之一，属于食源性人兽共患寄生虫。主要宿主是地处热带及亚热带地区的奶牛、水牛、山羊等家畜[1-2]。据估计，全世界畜牧业每年因片形吸虫病造成的损失超过32亿美元[3]。另外在全球范围内，已有至少240万人感染片形吸虫病，并同时威胁着1.8亿人的健康安全，被世界卫生组织认定为最受忽视的热带病之一[4-5]。针对该疾病的诊断主要包括临床诊断、分子生物学诊断、免疫学诊断，其中免疫学抗原诊断因具备灵敏性高、特异性强、低成本等优点被广泛应用于该疾病检测的开发研究中[5-6]。Abdolahi等[7]针对肝片形吸虫排泄-分泌产物(ESP)抗原制备特异性单克隆抗体和多克隆抗体，并建立了针对机体粪便中片形吸虫抗原的ELISA检测方法。经验证，该方法阳性样本检出率为90%，特异性达89.7%，具备应用于临床片形吸虫病诊断要求。Anuracpreeda等[8]针对大片形吸虫脂肪酸结合蛋白构建了特异性单克隆抗体及ELISA抗原检测方法，在符合基础诊断要求的同时，在早期诊断方面也呈现出较好的潜力。

组织蛋白酶L1(cathepsin L1,Cat L1) 是一种半胱氨酸蛋白酶，在许多寄生虫体内均有表达，主要由幼虫和成虫的消化道真皮上皮细胞分泌[9]，在虫体寄生定植等过程中起到重要的作用[10-13]。此外，Cat L1也被证明可抑制机体的Th1型免疫反应，从而提高外界病原感染风险[14-15]。王晓旭[16]成功对肝片形吸虫Cat L1进行了原核重组表达，获得了rFhCat L1并建立了间接ELISA诊断方法，经检测该方法特异性为97.3%，敏感性为94.0%，最早可以检出人工感染肝片形吸虫28 d后的绵羊血清。证明Cat L1在片形吸虫病诊断方面是具备相关潜力的。

近年来关于片形吸虫免疫与防治的研究一直在不断深化，但是现有的商业化诊断试剂盒存在成本较高、功能不够全面的缺点，且国内尚未有商品化试剂盒生产。本研究以前期所制备的rFgCat L1原核表达蛋白及抗rFgCat L1多克隆抗体[17]为基础，制备抗rFgCat L1单克隆抗体并构建大片形吸虫病双抗体夹心ELISA检测方法，以期为开发大片形吸虫病快速抗原检测诊断试剂盒提供重要的理论依据及物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠购自湖南省长沙市天勤生物技术有限公司；SP2/0细胞株、rFgCat L1蛋白、抗rFgCat L1多克隆抗体：广西大学动物科技学院动物寄生虫疾病与免疫学实验室制备，液氮中保存；试验所用血清样本均采自广西地区某养殖厂。

细胞融合试剂盒购自GENMED公司；DMEM基础培养基、胎牛血清、HAT均购自Biological Industry公司；青-链霉素混合液(双抗)购自Solarbio公司；山羊抗鼠IgG抗体亚型鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司；特超敏ECL化学发光试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗均购自上海碧云天生物技术有限公司公司；Protein L 抗体纯化试剂盒购自金斯瑞生物科技有限公司。倒置显微镜(AE31)购自Nikon公司；超净工作台(SW-CJ-2FD)购自苏净设备有限公司；CO2培养箱(3111)购自Forma Scientific公司；电热恒温水箱HH-S6型购自北京长风有限公司；恒温培养箱(DNP-9052)购自上海跃进医疗器械公司；-80 ℃超低温冰箱(DW-HL778)购自Forma公司；细胞计数仪(TC20)购自Bio-Rad公司；液氮罐(XK02-201)购自四川亚西橡塑机器有限公司。

1.2 小鼠免疫

调整rFgCat L1蛋白浓度为1 mg/mL，分4次对5只BALB/c小鼠进行免疫。前3次免疫采用50 μL蛋白液与弗氏佐剂等体积混合，皮下多点注射免疫。第3次免疫结束7 d后，尾静脉采小鼠血清。通过间接ELISA法测定血清中抗体效价，未免疫小鼠血清作为阴性对照，对抗体反应最高的小鼠采用100 μL抗原蛋白腹腔注射进行冲击免疫。

1.3 杂交瘤细胞株构建

提前24 h制备饲养层细胞，用HAT培养基重悬，按104/孔平铺在96孔板中；在超净台内分离小鼠脾细胞，采用细胞筛研磨并用含20%胎牛血清的完全培养基重悬计数。将SP2/0细胞及小鼠脾细胞按1∶5的比例(SP2/0：2×106个，小鼠脾细胞：1×107个)加入至50 mL离心管中，300×g离心10 min，洗涤3次；加入37 ℃预热细胞融合剂，常温静置1 min，加入终止液，300×g离心10 min，洗涤3次；吸弃上清，利用2% HAT培养基重悬细胞，加至预先制备含饲养细胞的96孔细胞培养板中，100 μL/孔，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。 细胞融合后培养24 h后，观察细胞状态；待细胞团达肉眼可见后取上清，采用间接ELISA法进行鉴定，SP2/0细胞培养上清作为阴性对照；对阳性孔进行放大培养，并对强阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，期间及时冻存细胞；亚克隆3次以后，选取阳性值较高且稳定的杂交瘤细胞株为最终的阳性杂交瘤细胞株。

1.4 单克隆抗体制备及鉴定

1.4.1 单克隆抗体制备 准备6～8周龄BALB/c小鼠20只，注射前提前1周腹腔注射灭菌液体石蜡，500 μL/只；将所制备阳性杂交瘤细胞株按1×106/只注入小鼠腹腔；14 d后，待小鼠腹部明显膨大，精神状态不佳时开始逐步抽取腹水；用Protein L 抗体纯化试剂盒对小鼠腹水中抗rFgCat L1单克隆抗体进行纯化，并进行SDS-PAGE电泳。

1.4.2 单克隆抗体效价鉴定 将杂交瘤细胞株上清(按1∶2、1∶22、1∶23至1∶212稀释)及小鼠腹水(按1∶10、1∶102、1∶103至1∶108稀释)通过间接ELISA法检测抗体效价。

1.4.3 单克隆抗体亚型Western blotting鉴定 利用Goat Anti-Mouse Ig抗体亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型。具体步骤：PBS稀释rFgCat L1至浓度为2 μg/mL，每孔100 μL加入ELISA酶标板中，4 ℃孵育12 h；PBST洗涤3次，加入1% BSA，100 μL/孔，室温下放置1 h，阻断自由结合位点；PBST洗涤3次，每孔加入100 μL杂交瘤细胞上清，室温下轻摇孵育1 h或4 ℃过夜；PBST洗涤3次，将检测抗体，用1% BSA按1∶250～1∶500稀释，100 μL/孔，轻摇孵育1 h；PBST洗涤5次，加入显色液，室温静置20 min；酶标仪读取各孔D450 nm值。

1.4.4 单克隆抗体特异性鉴定 采用常规Western blotting法验证抗rFgCat L1单克隆抗体特异性：将FgESP、前后盘吸虫抗原、伊式锥虫抗原、弓形虫抗原进行SDS-PAGE电泳；一抗为抗rFgCat L1杂交瘤细胞上清，二抗为兔抗鼠-IgG酶标二抗；通过Image Lab软件查看结果。

1.4.5 单克隆抗体识别抗原表位鉴定 参考万文徽[18]方法进行叠加ELISA试验，对7G6及5D5抗原识别表位进行鉴定。具体方案为：按2 μg/mL 浓度稀释天然FgESP包被酶标板；分别孵育2株单克隆抗体，所测得D450 nm值记为A1及A2；后将2株抗体等比例混合后孵育，所测D450 nm值记为A12；根据公式：AI(%)=(A12-A1)/A2×100%；AI(%)>30%,证明2株抗体具有相加作用，识别不同抗原表位。AI(%)<30%，证明2株抗体呈竞争作用，识别相同表位。

1.5 双抗体夹心ELISA方法的构建

1.5.1 单抗包被浓度及抗rFgCat L1多克隆抗体稀释度筛选 采用包被缓冲液稀释单克隆抗体，分别用 0.4、2、10和50 μg/mL共4个浓度的单抗包被96孔酶标板，包被96孔板；37 ℃孵育2.5 h，4 ℃过夜；采用PBST洗涤3次，加入封闭液，37 ℃孵育2 h；PBST洗涤3次，加入阴/阳性对照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤4次，抗rFgCat L1多克隆抗体[17]按1.56、3.12、6.25、12.5和25 μg/mL稀释，棋盘法加样，37 ℃孵育1 h；加入显色液37 ℃孵育25 min；加入终止液，50 μL/孔，用酶标仪测定D450 nm值；计算阴性/阳性(P/N)值，最大值所对应条件为最佳检测条件。

1.5.2 酶标二抗最佳稀释度筛选 步骤同1.5.1，将山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗按1∶125、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000和1∶8 000倍比稀释，计算P/N值，最大值所对应条件为最佳检测条件。

1.5.3 最适封闭液筛选 步骤同1.5.1，用10%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉、5% BSA和1%明胶分别进行封闭，计算P/N值，最大值所对应的为最佳封闭液。

1.5.4 显色时间筛选 步骤同1.5.1，加入显色液，37 ℃孵育10、15、20、25、30和60 min。 计算P/N最大值所对应时间为最佳显色时间。

1.6 双抗体夹心ELISA方法的验证

1.6.1 敏感性 步骤同1.5.1，将rFgCat L1从10 μg/mL倍比稀释至0.078 μg/mL作阳性样品，PBS作为阴性对照。通过所构建双抗体夹心ELISA法检测各浓度下的D450 nm值并计算P/N值(P/N>2.1即为阳性)，得到最低抗原检测浓度，验证该方法敏感性。

1.6.2 特异性 步骤同1.5.1，利用所构建双抗体夹心ELISA法对rFgCat L1、FgESP抗原、前后盘吸虫ESP抗原、伊氏锥虫体表蛋白抗原、弓形虫虫体抗原进行检测，并以PBS为阴性对照，P/N>2.1判定为阳性，验证方法特异性。

1.6.4 临床样本验证 步骤方法同1.5.1，利用所构建双抗体夹心ELISA法检测本实验室保存的47份山羊大片形吸虫病阳性血清及47份奶牛大片形吸虫病阳性血清的阳性符合率。

2 结 果

2.1 小鼠免疫结果

终免后小鼠状态良好，未出现死亡现象。三免后小鼠血清间接ELISA法检测结果显示，4只小鼠血清抗体效价均>104，达到细胞融合要求。 四免后剖检小鼠发现小鼠脾脏组织较未免疫小鼠有明显增大。

2.2 阳性杂交瘤细胞株构建

杂交瘤细胞株培养25 d时肉眼即可观察到细胞团，细胞长势良好，融合细胞孔达116个(总孔数为384个)；间接ELISA法检测细胞上清结果显示：共有8株杂交瘤细胞上清呈阳性反应，其中5D5及7G6呈现强阳性反应(表1)；亚克隆培养结果显示，5D5及7G6 2株细胞上清阳性反应稳定，可进行扩大培养并冻存(表2)；5D5及7G6经传代培养和冻存后，细胞上清检测阳性值趋于稳定(表3)，可用于大量制备抗体。

表1 rFgCat L1阳性克隆筛选结果

表2 连续亚克隆后杂交瘤分泌抗体稳定性(D450 nm值)

表3 连续传代后杂交瘤分泌抗体稳定性(D450 nm值)

2.3 单克隆抗体制备及鉴定

2.3.1 抗体制备结果 小鼠腹水纯化后，可见除抗体外无明显杂蛋白，抗体重链在50 ku左右，轻链约为20 ku(图1)。

M，蛋白质分子质量标准；1，纯化后5D5；2，纯化后7G6

2.3.2 单克隆抗体效价测定结果 间接ELISA法检测结果显示，5D5和7G6 2株细胞上清抗体效价分别达到29和210；5D5小鼠腹水抗体效价达107，7G6小鼠腹水抗体效价可达108(表4)。

表4 间接ELISA测定抗体敏感性结果

2.3.3 抗体亚型鉴定结果 单克隆抗体鉴定试剂盒鉴定结果显示，5D5和7G6 2株细胞制备的抗体的亚型均为IgG1型，轻链均为Kappa型(图2)。

图2 单克隆抗体亚型鉴定

2.3.4 单克隆抗体特异性检测结果 Western blotting检测结果显示，2株单抗均可与天然FgESP抗原反应，而不与前后盘吸虫抗原、伊式锥虫抗原、弓形虫抗原反应(图3)。

1,大片吸虫分泌-排泄产物；2，前后盘吸虫抗原；3，伊氏锥虫抗原；4，弓形虫抗原

2.3.5 单克隆抗体识别抗原表位鉴定结果 间接ELISA法检测5D5及7G6的抗原识别表位结果显示，A12<30%，5D5和7G6识别相同表位。根据结果2.3.2可知，7G6抗体效价高于5D5，因此确定用7G6作为捕获抗体、抗rFgCat L1多克隆抗体作为检测抗体进行大片形吸虫病双抗体夹心ELISA法的构建。

2.4 双抗体夹心ELISA方法构建

2.4.1 7G6包被浓度及抗rFgCat L1多克隆抗体稀释度的筛选结果 棋盘法筛选7G6抗体包被浓度及抗rFgCat L1多克隆抗体检测浓度结果显示，当7G6包被浓度在2 μg/mL、抗rFgCat L1多克隆抗体浓度为25 μg/mL时，所得结果P/N值最高，且此时阴性对照值<0.1，有利于更好地区分阴阳性(表5)。因此，以此结果为后续检测条件。

表5 7G6和抗rFgCat L1多克隆抗体最佳稀释度

2.4.2 酶标二抗稀释度筛选结果 通过倍比稀释山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗，结果显示，当稀释度为1∶4 000时，P/N值最高(表6)。因此，选择1∶4 000为最佳稀释度。

表6 酶标二抗稀释度选择

2.4.3 封闭液筛选结果 经对比5% BSA、5%脱脂奶粉、10%脱脂奶粉及1%明胶的包被效果，结果显示5%脱脂奶粉作为封闭液时P/N值最高，此条件下本底值较低，更易区分阴阳性，所以选择5%脱脂奶粉为最终封闭液(表7)。

表7 最佳封闭液选择

2.4.4 显色时间筛选结果 孵育不同时间的结果表明，在孵育20 min时，D450 nm值开始趋于稳定，且25 min时P/N值达到最高(图4)。因此，确定最终的底物显色时间为25 min。

图4 最佳显色时间测定

2.5 双抗体夹心ELISA方法的验证

2.5.1 敏感性检测结果 通过梯度稀释rFgCat L1，并以 PBS 做阴性对照验证双抗体夹心ELISA方法的敏感性， 结果显示： 双抗体夹心ELISA方法所能测的最低抗原浓度为0.625 μg/mL(表8)。

表8 敏感性检测结果

2.5.2 特异性检测结果 验证结果显示，所构建双抗体夹心ELISA方法检测FgESP、前后盘吸虫抗原、伊氏锥虫抗原以及弓形虫抗原的P/N值分别为4.27、0.85、1.33和1.26，证明该方法具备较好的特异性。

2.5.4 临床样本验证结果 通过所构建双抗体夹心ELISA方法对实验室所保留的47份山羊及47份奶牛感染性血清样本进行抗原检测，结果显示山羊血清共检出抗原阳性37份，抗原检出率为78.7%；奶牛血清共检出抗原阳性34份，抗原检出率率为72.3%(表9)。

3 讨 论

免疫学抗原诊断的关键在于需要制备具备高特异性及敏感性的单克隆抗体。单克隆抗体技术发明于20世纪70年代，由于其针对免疫疾病方面检测的优越性，已经广泛应用于疾病诊断及治疗等多个领域[19]。为筛选优质抗体，本试验在亚克隆阶段采用传统有限稀释法培养。任瑞敏等[20]利用半固体培养基培养杂交瘤细胞。半固体培养基优势在于同一个孔中的不同细胞株不易混合，在亚克隆阶段，可借助显微镜从细胞团中挑出单个细胞，减少了传统细胞稀释的工作量，提高筛查效率。但同时增加了细胞污染的几率。其次，在细胞培养过程中，由于固体培养基所含水分较少，在37 ℃恒温培养箱中加速了液体流失的速度，若不能每天及时补充水分，细胞可因缺水而死亡[21]。而传统的有限稀释法在亚克隆阶段虽然需要更大的工作量，但是对于细胞的培养更加稳妥及安全。多项报道[22-24]表明，利用有限稀释法可成功获得稳定的阳性杂交瘤细胞株。本试验利用该方法成功筛选出具备高效价的强阳性株5D5和7G6。经验证，2株抗体效价可达29和210，对于后续所构建方法的敏感性是具备优势的。李雪等[25]利用抗FgESP复合抗原单克隆抗体7D1、7D2构建了大片形吸虫双抗体夹心ELISA方法，结果显示该方法可特异性识别大片形吸虫抗原，不与胰阔盘吸虫抗原、前后盘吸虫抗原、伊氏锥虫抗原及弓形虫抗原反应。而本实验所构建单克隆抗体针对的是单一蛋白，理论上更具特异性。经验证2株抗体均可特异性结合大片形吸虫ESP抗原，具备作为检测抗体的潜力。但在对抗体的识别表位鉴定试验中发现，2株单克隆抗体本身存在识别抗原位点方面存在竞争关系，同时为了使所构建方法检测灵敏度更高，本试验未选择双单克隆抗体夹心，而是选择实验室前期所构建的抗FgCat L1特异性多克隆抗体与单克隆抗体结合的方式，使得该方法可同时兼具敏感性及特异性的优点。李超等[26]利用多克隆抗体及单克隆抗体结合的方法，构建双抗夹心ELISA法，结果显示该方法对检测牛γ-干扰素呈现出理想的效果。

利用7G6和rFgCat L1多克隆抗体所构建的双抗体ELISA检测方法，对47份山羊及47份奶牛大片吸吸虫感染性样本进行检测发现，抗原检出率达78.7%及72.3%，与间接ELISA法检测结果有所出入，原因可能是通过间接ELISA法检测抗体判定疾病的发生不易区分既往感染及当症感染，易出现假阳性，而本方法检测的目的分子为循环抗原，对于疾病的确诊及病程的判断更具敏感性[25]。后续试验除利用血清样品外，可同时收集机体粪便、乳液和唾液等临床样本，进一步验证其检测效果，为商业化检测试剂盒的研制提供新的思路及依据。

4 结 论

本研究成功制备抗rFgCat L1特异性单克隆抗体5D5和7G6，并结合rFgCat L1多克隆抗体构建了大片形吸虫病双抗体夹心ELISA检测方法。经验证，该方法抗原最低识别浓度为0.625 μg/mL，可特异性识别FgESP抗原；另外，该方法对山羊及奶牛大片形吸虫病阳性血清的抗原检出率为78.7%及72.3%，说明其具备构建大片形吸虫病商业化试剂盒的潜力。