大肠杆菌噬菌体BP16对鸡大肠杆菌病的防治效果

李 敏，赵尊福，阳亭亭，张焕容

(西南民族大学畜牧兽医学院，成都 610041)

禽致病性大肠杆菌是肠道外致病性大肠杆菌的一个亚群，可引起鸡的大肠杆菌病，导致局部或全身性的感染[1]，被感染后的家禽出现败血症、心包炎、腹膜炎、输卵管炎等多种不同的临床症状和病理变化，感染后痊愈的家禽大多消瘦[2-3]，给养鸡业带来严重的经济损失。在畜禽养殖生产过程中，由于抗生素的不合理使用导致细菌的耐药谱变宽、耐药性增强等一系列问题，使细菌性疾病治疗变得困难，养殖成本增加[4]。噬菌体在环境中广泛存在，具有宿主特异性，可以靶向感染宿主菌，从而裂解相应的致病菌，且不会影响其他正常菌群[5-8]。目前噬菌体已成功用于人类和动物细菌性疾病的靶向治疗[9]。由于抗生素耐药性越来越严重，噬菌体可部分替代抗生素，用于治疗细菌性疾病[10]。噬菌体治疗与抗生素一样，也存在药代动力学，故噬菌体的滴度及其在体内作用的有效治疗时间是有限的[11-13]，因此，探究噬菌体的最佳治疗剂量非常必要。本研究为评价一株宽裂解谱大肠杆菌噬菌体BP16防治鸡大肠杆菌病的效果，在雏鸡攻毒前后不同时间腹腔注射大肠杆菌噬菌体BP16，并探究该噬菌体的最佳治疗剂量，以期为后续研究鸡大肠杆菌噬菌体制剂提供思路。

1 材料与方法

1.1 噬菌体、细菌及试验动物

噬菌体BP16和O2血清型禽致病性大肠杆菌均由西南民族大学动物医学实验室分离鉴定并保存[14]。 1日龄罗曼灰公雏鸡购自成都某蛋鸡孵化场。

1.2 主要试剂及仪器

胰蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母提取物购自上海蓝季科技发展有限公司；NaCl购自天津市致远化学试剂有限公司；琼脂粉购自天津市科密欧化学试剂开发中心；SM缓冲液购自上海信帆生物科技有限公司。电热恒温水浴锅购自上海一恒科学仪器有限公司；恒温培养箱购自上海和呈仪器制造有限公司；超净工作台购自浙江孚夏医疗科技有限公司；高速冷冻离心机购自赛默飞世尔科技有限公司；0.22 μm无菌一次性针头式滤器购自北京索莱宝科技有限公司；恒温摇床购自上海世平实验设备有限公司。

1.3 大肠杆菌半数致死量(LD50)测定

将O2血清型禽致病性大肠杆菌新鲜培养物菌液稀释成5×1010、5×109、5×108、5×107和5×106CFU/mL 5个浓度梯度；30只7日龄雏鸡随机分为6组，每组5只，5个试验组采用腹腔注射的方式分别接种0.2 mL上述不同浓度的菌液，对照组腹腔注射0.2 mL生理盐水；饲养观察7 d并记录各组死亡数量，采用Reed-Muench法测定LD50，剖检病死鸡观察病理变化。

1.4 大肠杆菌药敏试验

为筛选用于防治试验作为阳性对照的药物，选取13种常用的对革兰阴性菌有抑菌或杀菌作用的药敏纸片进行药敏试验。根据美国临床检验委员会(NCCLS)推荐的药敏试验结果判定细菌对药物的敏感程度[15]。

1.5 噬菌体BP16裂解液无菌检验

取20 μL经0.22 μm滤器滤过除菌的噬菌体裂解液，滴加到LB固体培养基上，用灭菌后的涂布棒涂抹均匀，于37 ℃培养箱中倒置培养24 h，观察有无杂菌生长。

1.6 噬菌体BP16悬液安全性检验

选取20只健康的7日龄雏鸡随机分为2组，每组10只，第1组腹腔注射0.2 mL 3×109PFU/mL的噬菌体悬液，第2组腹腔注射0.2 mL生理盐水作为对照组，饲喂14 d观察各组鸡是否表现出临床症状。

1.7 噬菌体BP16防治禽大肠杆菌病的效果评价试验

将80只健康的7日龄雏鸡随机分为8组，每组10只，1～5组为试验组，6～8组为对照组，除第8组外，其余各组均腹腔注射1.5×108CFU的菌液。5个试验组分别在感染前6 h、感染前3 h、感染同时、感染后3 h、感染后6 h腹腔注射1.5×108PFU的噬菌体悬液；第6组为氟苯尼考治疗组，给药方案按说明书推荐剂量及次数进行给药(即将氟苯尼考注射液以纯水稀释10倍，按照0.7 mL/kg BW的剂量注射,并每隔48 h注射一次，连续给药2次)；第7组腹腔注射1.5×108CFU菌液作为感染对照；第8组腹腔注射0.2 mL生理盐水作为空白对照，各组在同等条件下饲养观察7 d，除氟苯尼考治疗组外，治疗疗程均为给药一次，并记录各组鸡死亡率。

1.8 最佳治疗剂量试验

选取60只健康的7日龄雏鸡，随机分为6组，每组10只，1～5组为试验组，第6组为对照组。将全部雏鸡腹腔接种1.5×108CFU的菌液，攻毒后第1～5组立即分别腹腔接种1.5×106、1.5×107、1.5×108、1.5×109和1.5×1010PFU的噬菌体裂解液，对照组腹腔注射0.2 mL生理盐水，自由采食，饲养7 d，观察并记录雏鸡的死亡率。

2 结 果

2.1 大肠杆菌LD50测定结果

采用Reed-Muench法，根据表1中数据算出O2血清型大肠杆菌LD50为1.5×108CFU/mL，剖检死亡鸡可见心脏和肝脏表面有纤维素性渗出，腺胃浆膜面和肠道黏膜面有出血点。

表1 大肠杆菌LD50测定结果

2.2 药敏试验结果

根据药敏试验结果可知，该O2血清型大肠杆菌菌株对氨苄西林、阿莫西林、链霉素和四环素均耐药，对沙星类药物和氟苯尼考敏感(表2)，由于临床常用氟苯尼考治疗禽大肠杆菌病，所以选取氟苯尼考作为后续试验阳性对照的药物。

表2 药敏试验结果

续表

2.3 噬菌体裂解液无菌检验结果

BP16噬菌体裂解液涂布在LB固体培养基上经24 h培养后，未发现任何菌落生长，说明裂解液中无杂菌，符合下一步试验要求。

2.4 噬菌体裂解液安全性试验结果

注射BP16噬菌体悬液的试验组鸡均正常饮水采食，未出现精神不振、腹泻拉稀、被毛凌乱等临床症状，剖检后各组织器官未发现病理变化，说明噬菌体悬液安全。

2.5 噬菌体防治大肠杆菌病的效果

由表3可知，在雏鸡感染大肠杆菌前6 h和前3 h接种噬菌体悬液，保护率均达到100%，与攻毒组相比，死亡率降低60%，在雏鸡感染大肠杆菌同时、感染后3 h和感染后6 h接种噬菌体悬液，保护率分别为80%、80%和70%。抗生素治疗组的保护率为70%，除第5组与抗生素治疗组的保护率相同之外，其余试验组的保护率均高于抗生素治疗组。结果表明，雏鸡在感染大肠杆菌前6 h接种噬菌体能有效预防大肠杆菌病，在感染同时至感染后6 h内接种噬菌体，能有效治疗大肠杆菌病，且治疗效果优于该病原菌敏感的抗生素。

表3 噬菌体防治大肠杆菌病试验结果

2.6 最佳治疗剂量试验结果

由表4可知，随着噬菌体治疗剂量的增加，雏鸡的保护率也显著提高，噬菌体治疗剂量为1.5×109PFU时，雏鸡的保护率能达到100%。所以，攻毒剂量为1.5×108CFU时，噬菌体治疗剂量为1.5×109PFU才能达到最佳的治疗效果。

表4 最佳治疗剂量试验结果

3 讨 论

Lau等[16]报道宿主在被大肠杆菌入侵后，会在被感染的部位释放出炎症介质，导致血管通透性增加，此时会有纤维素性渗出，说明大肠杆菌已随血液感染至全身，传播到其他器官。本研究通过腹腔接种途径测定O2血清型禽致病性大肠杆菌的LD50，剖检病死鸡可见肝脏、心脏表面有纤维素性渗出，成功建立了大肠杆菌雏鸡腹腔感染模型。禽致病性大肠杆菌是肠道外致病性大肠杆菌中的一种，因此，本研究通过腹腔接种人工感染禽致病性大肠杆菌，而非常用的经口感染途径。已有研究证实，噬菌体不同接种途径对大肠杆菌病的防治效果有差异[17]，噬菌体注射与气溶胶吸入相比，注射途径动物体内的噬菌体水平更高且更持久[18]，路建彪等[19]研究证明腹腔注射噬菌体的效果优于口服的方式，本研究结果表明，通过腹腔注射接种禽大肠杆菌噬菌体可在一定程度上防治大肠杆菌病。

本研究在雏鸡感染大肠杆菌前6 h和前3 h接种噬菌体，保护率均达到100%，说明腹腔注射大肠杆菌噬菌体对禽大肠杆菌病有预防的作用。由于注射了噬菌体裂解液，攻毒的菌液和噬菌体裂解液在腹腔相互作用，阻止了致病菌在体内的扩散，可有效预防和治疗经腹腔人工感染的大肠杆菌。噬菌体无毒副作用[20-21]，但只在致病菌感染部位复制增殖发挥作用，而抗生素会随血液遍布全身，不局限在感染部位。本研究中噬菌体治疗效果优于抗生素治疗，与杜新永等[22]和张博等[23]研究结果一致，但根据噬菌体的生长繁殖特性分析，噬菌体治疗局部感染的效果可能要优于治疗全身感染。Payne等[24]在探究噬菌体的药代动力学时发现，当细菌的密度足够高时，感染细菌的细胞数量超过噬菌体的数量，噬菌体才会达到有效的剂量。本研究中当噬菌体治疗剂量增加时，对雏鸡的保护率也显著提高，所以高剂量噬菌体有助于提高治疗效果。

孙浩宇[25]以5×109CFU/mL的沙门菌攻毒1日龄雏鸡，雏鸡饮水中添加噬菌体饲喂8 d后，在肝脏、脾脏中均未检出攻毒菌株，之后对50 000只新进雏鸡使用噬菌体饮水预防沙门菌病，后期花费的药品成本极低，且最终出栏率达95%以上，这一实践证明噬菌体防治在养殖业可得到广泛应用。在本试验中，当攻毒剂量为1.5×108CFU时，噬菌体治疗剂量为1.5×109PFU达到最佳的治疗效果。根据前期试验结果[14]，噬菌体BP16最佳感染复数(MOI)为1，理论上噬菌体治疗剂量为1.5×108PFU就可取得最佳的治疗效果，而实际应用中1.5×109PFU治疗效果最佳，表明在实际生产中进行体内治疗时，可根据体外测定的最佳感染复数，适当提高其用量。

4 结 论

以禽致病性大肠杆菌为宿主菌分离鉴定的宽裂解谱噬菌体BP16可有效治疗由O2血清型大肠杆菌感染引起的雏鸡大肠杆菌病，本研究为开发大肠杆菌噬菌体防治制剂提供了参考。