普洱地区桉树林根际土壤真菌群落结构和多样性研究

郭 洁，樊竹青，赵利坤，李沂韦

普洱学院 云南省高校亚热带药用食用生物资源开发与利用重点实验室，云南 普洱 665000

桉树是桃金娘科（Myrtaceae）桉属（Eucalyptus）植物的统称，常绿高大乔木，具有药用、经济等多种价值。桉树的种植对我国很多地区经济发展做出了贡献，同时对周边生态环境也带来很大负面影响。桉树被称为土壤的“抽水机”和“抽肥机”，长期种植会造成土壤贫瘠、生态物种单一、威胁其他的生物生长，降低了生物多样性。桉树人工林取代次生林降低了植物物种丰富度和表面覆盖率，显著降低了土壤微生物群落功能[1]。

土壤根际微生物物种多样性是评价土壤生态系统健康程度的重要指标，土壤微生物物种越丰富，生态系统对外界破坏的抵抗能力和自我修复能力就越强，生态系统就越稳定。据相关调查显示，覃玉球[2]在《桉树产业发展现状及对生态环境的影响分析》一文中提到大规模种植桉树之后，桉树林生态系统中很多生物的种类均有下降。我国学者对广西地区桉树林中的植物分布进行了调查，其结果表明桉树林中草本植物和蕨类植物的种类和数量都随着桉树林树龄的增加呈缓慢下降的趋势。

目前，国内外对于桉树的研究比较系统全面，主要研究方向集中在桉树的栽培繁殖技术、病虫害管理防治、土壤的理化性质、生态及生物多样性等，对于桉树根际土壤真菌多样性的研究不多见[3]。本研究以云南景谷地区不同海拔人工桉树林地根际土壤作为研究对象，采用高通量测序方法，对土壤样品进行DNA提取、扩增、测序及数据处理，分析不同海拔桉树林根际土壤真菌群落多样性、群落组成和丰富度情况，以期为景谷当地长期种植桉树造成的生态效应修复提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

本次研究样地位于云南普洱景谷县（东经100°02′～101°07′、北纬22°49′`23°52′）。景谷县位于回归线附近，属于南亚热带地区，地势以山地高原为主，海拔在600m～2 920m之间，年降水量为1 354mm、平均雨日数164.1d、平均气温22.1℃，年平均日照时数2 065.3h。景谷县林业用地有874.9万亩，占总面积的77.5%，桉树就是景谷地区重要的经济林。

1.2 样品采集及处理

样品采于2022年1月，在研究样地内，土壤样品采自景谷县内的人工桉树林根际土壤，在向阳坡面设置两个不同海拔梯度，A1（1 056m），A2（1 156m），在每个海拔随机选取5个25m×25m样方，每个样方内选用“五点”采样法采样，去除表层土壤，取5-10cm深的桉树根际土样，将五个小点的土样混合为一个土样，最后将5个样方的土样混合，按四分法土样作为实验样品，总共取得2个实验样品，分别封入无菌塑封袋并置于4℃冰盒中，立即将样品送回实验室进一步处理[4]。

1.3 土壤真菌DNA提取和测序

1.3.1 土壤真菌DNA提取PCR扩增16srRNA基因

根据E.Z.N.a.土壤DNA试剂盒（Omega，美国）进行土壤微生物总基因组DNA提取，为了确保提取过程中得到足够数量和高质量的基因组DNA，使用Quabit 2.0（美国life）测量DNA浓度。对微生物ITS1-ITS2高变区进行itsS rRNA基因的提取，PCR引物进行扩增，扩增子PCR正向引物为：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；反向引物为：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。提取的DNA2ul（10ng/μl），扩增子正反向引物各1ul（10uM），进行PCR扩增，扩征程序如下：95℃三分钟变性1个周期，95℃30秒变性5个周期，45℃下退火30S，72℃下延伸30S，95℃下变性20个周期30S，55℃下退火30S，72℃下延伸30S，72℃下最终延伸5分钟。在TBE缓冲液中，用1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，用溴化乙锭（EB）染色，在紫外光下观察[5-6]。

1.3.2 ITS基因文库的构建、量化和测序

该阶段由生工生物公司（上海）完成。

1.4 数据分析

将测序得到的PE reads先根据overlap关系进行拼接，区分样本后对序列质量进行质控和过滤，然后进行OTU聚类（ASV去噪）分析和物种分类学分析。基于OTU聚类（ASV去噪）分析结果，对OTU（ASV)进行多样性指数分析，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。

2 结果与分析

2.1 桉树根际土壤真菌测序结果

对采集的两个不同海拔人工桉树林根际土壤样品进行测序，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，将所有优化序列比对至OTU代表序列，选出与代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格，结果见表1。

表1 不同海拔人工桉树林根际土壤真菌OTU测序结果

2.2 桉树根际土壤真菌OTU结果分析

以OTU水平为例对两个样品进行处理后，绘制Venn图（图1），共统计出人工桉树林下两个土壤样品共有761个OTUs，由图1可知两个样品包含的OTU数目分别为A1样品465个，A2样品553个，A2样品OTUs数目相对多。257个OTUs为两个样品共有，每个样品都有接近50%的OTUs相同，样品1和2的真菌群落组成和重叠量有一半相同。

图1 不同海拔人工桉树林根际土壤真菌OTU韦恩图

2.3 桉树根际土壤真菌相对丰富度分析

为了研究桉树林下土壤中真菌的物种组成和多样性，进行OTU聚类分析，根据OTU聚类分析，使用统计学的分析方法，以纵坐标为桉树根际真菌相对丰度值，测A1、A2样本在不同分类水平上的群落结构和所占比例得出相应数据和图表（图2、表2）。由图2可知，两个样品经测序后共统计得到3个门类的真菌群落，不包含其他未统计的门类（样本中丰度占比均小于一定比例1%的物种归为其他）。林忠鑫[5]等人从不同连载代次桉树人工林土壤真菌群落结构和多样性研究中共统计得到真菌门类为11门，物种差距可能是由于样品采集季节和数量不一样导致。A2样品物种和数量较A1相对均衡。根据表2可知，A1样品的优势门类真菌为子囊菌门，占整个A1样品中总真菌群落丰富度的86.2%，A2样品的子囊菌门占33.7%，A1样品显著高于A2样品。A2样品的优势门类真菌为担子菌门，占A2样品总真菌群落丰富度的37.96%，而A1样品担子菌门占比为12.25%，A2样品的担子菌门显著高于A1样品。通过以上数据得知，子囊菌门和担子菌门为人工桉树林根际土壤真菌群落的优势物种。不同的海拔梯度，其优势物种的数量和丰富度不一样。

图2 不同海拔梯度桉树林下土壤真菌相对丰度柱状图

表2 不同海拔梯度桉树林下土壤真菌主要菌门相对丰度统计表

2.4 不同海拔梯度桉树林下根际土壤真菌系统组成树状图

根据两个样本的分类学统计结果进行比对，对优势门类进行分类，对优势真菌群落进行进化关系和丰富度差异分析，构建真菌系统组成树状图，具体结果见图3、图4。由图可知，A2样品的亲缘分类较A1样品更丰富，A2样品第一亲缘关系有三个分支，三个分支的均匀度相对平均，A1样品为两个分支，两个分支均匀度不一，由此可知，A2样品的真菌群落较A1样品的真菌群落丰富度和物种较平均。

图3 海拔1056m样品A1真菌群落组成树状图

图4 海拔1156m样品A2真菌群落组成树状图

2.5 不同海拔梯度桉树林下根际土壤Alpha多样性

不同的海拔梯度模式会显著影响桉树人工林根际土壤真菌群落的多样性和丰富度（P＜0.01，表3）。Chao指数和Ace指数均为A2样品高于A1样品，说明海拔越高土壤中真菌丰富度越高（表3）。Shannon指数和Simpson指数反映土壤微生物的群落物种分布多样性，A2样品的Shannon指数为3.83，高于A1样品的1.60，A2样品的Simpson指数为0.07低于A1样品0.54，两个指数表现有差异。

表3 不同海拔梯度桉树林下根际土壤真菌各样本多样性指数结果

3 讨论

通过对云南景谷地区不同海拔梯度人工桉树林下根际土壤进行高通量测序和相关性分析，对两份土样的微生物真菌群落结构和数量特征进行分析，土壤微生物数量和种类作为土壤生态环境健康程度的重要指标，对土壤生态环境有很重要的影响。

本研究结果显示，海拔高度1 156m（A2样品）的物种较海拔高度1 056m（A1样品）丰富且生物量相对均衡；海拔高度1 056m（A1样品）的物种较海拔高度1 156m（A2样品）生物量较高，主要集中在子囊菌门，造成此结果的原因可能是因为海拔高，温度较低，桉树林下有机物质分解速率慢，养分代谢活动相对慢，保存的土壤养分较低海拔的丰富，能满足更多的微生物生长需要。而海拔相对较低的样地，温度相对较高，土壤生物活动活跃，土壤有机质代谢频繁，长期可能造成土壤里的营养物质降低，导致土壤贫瘠。桉树人工林长期种植后，会改变土壤理化性质，影响土壤水分和养分，使土壤微生物种类和数量特征发生变化[7-8]，海拔相对不是很高，温差不大时，海拔高的桉树林根际土壤养分更高[9]。另外，低海拔地区的人工桉树林人为活动频繁，日常的生产生活干扰较多，而高海拔地区的人工桉树林人为干扰较少，导致了高海拔地区的微生物和生物量比低海拔地区的丰富。

研究结果显示，人工桉树林土壤根际真菌物种多样性不丰富，与其他非桉树林土壤微生物多样性差别较大[10]。土壤微生物的多样性指数与土壤的理化性质息息相关，微生物是土壤养分的核心成员，长期的桉树种植对土壤破坏很大，桉树快速生长的同时大量吸取了周围土壤的水分和养料，对生态环境造成了一定的影响，会抑制桉树林下层的植物，造成植物种类的减少，从而影响生物的种类。

4 结论

景谷地区因长期种植经济树种桉树，由于桉树的化感作用和快速生长的同时对生态环境造成了很大的影响，本研究通过对人工桉树林下根际土壤真菌进行多样性分析，得出以下结论：景谷地区桉树林下土壤真菌门类单一，生物量不丰富。