印度梨形孢对樱桃番茄产量、品质及采后抗性的影响

王慧俐 郑晓冬

(1浙江特殊教育职业学院艺术系，浙江 杭州 310023； 2浙江大学食品生物科学技术研究所，浙江 杭州 310058)

樱桃番茄(LycopersiconesculentumMill.)起源于南美洲，其果实色泽鲜亮，酸甜可口，富含谷胱甘肽、番茄红素、类黄酮和芦丁等活性物质[1-4]，具有抗氧化、抗癌和防治心血管疾病等作用[5-6]，深受消费者喜爱。但因其果实皮薄汁多，采后呼吸作用旺盛，在贮运过程中易因机械损伤和病原菌侵染而引起腐烂变质，从而影响商品价值。目前，樱桃番茄采后保鲜方法主要有冷藏、气调贮藏、保鲜剂处理、精油处理及生物拮抗剂处理等[7-10]，同时已有研究表明影响果实采后耐贮性最关键的因素是果实采收时的品质[11-12]。因此，研究采前技术措施以提高樱桃番茄果实品质、延长贮藏期及提高果实采后抗性具有非常重要的意义。

印度梨形孢(Piriformosporaindica)是从印度塔尔沙漠中分离到的一种内生真菌。它能定殖于多种植物的根部，促进植物生长，改善品质，并能诱导植物系统抗性，增强植物抗逆性[13-18]。印度梨形孢和番茄互惠共生，能促进番茄植株的生长，提高番茄对早疫病、黄萎病和番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)等的抗性[19-22]。但目前鲜见接种印度梨形孢对樱桃番茄采后抗性影响的报道。本试验研究樱桃番茄苗期植株根部接种印度梨形孢对樱桃番茄产量、品质及采后抗性的影响，以期为其在樱桃番茄生产上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试樱桃番茄品种为杭杂5号，由杭州农业科学研究院蔬菜所提供。印度梨形孢来自德国耶拿大学Ralfoelmuller教授实验室。病原菌灰葡萄孢(Botrytiscinerea)及链格孢(Alternariaalternata)均为浙江大学食品生物技术实验室保存菌种。

1.2 试验方法

1.2.1 印度梨形孢菌培养 印度梨形孢在马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose agar，PDA)平板上25℃培养一周后用直径0.5 cm的无菌打孔器打孔，接种5个菌块到含马铃薯葡萄糖液体培养基(potato dextrose broth，PDB)的锥形瓶(50 mL/250 mL)中，培养一周(25℃，150 r·min-1)取出，4 000 r·min-1离心10 min，再用无菌水离心水洗3次收集菌丝体，将菌丝低速涡旋打碎2 min，备用。

1.2.2 樱桃番茄育苗与接种 选取饱满的樱桃番茄种子播种在装有育苗基质的32孔穴盘中，每孔1粒，苗床用电热线加温，置于温室大棚内常规管理。育苗期间白天平均温度约13℃，夜晚平均温度约6℃，日照4 h·d-1。栽培基质为加拿大发发得泥炭∶蛭石=3∶1(v∶v)混合调配，并用高压灭菌锅灭菌2 h。处理组栽培基质按1%(m∶v)加入印度梨形孢菌丝体和孢子的混合物，搅拌均匀，对照组不接菌，然后将两组栽培基质装入塑料盆(7 L)中，每盆约装3.5 L。选取株高及长势一致的4～5片真叶期秧苗60株，洗净根系后栽种于处理组和对照组塑料盆中，每盆2株苗，每组各15盆，将栽种好的塑料盆置于温室大棚内，两周后每盆各间去一株苗，整个生长期不使用任何杀虫或杀菌剂，其他按常规管理。

1.2.3 病原菌的培养与孢子悬浮液制备 在SW-CJ-1F超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)上分别挑取适量的供试病原菌灰葡萄孢及链格孢到PDA斜面，置于28℃ LRH-250生化培养箱(上海一恒科技有限公司)中培养7～14 d，置于4℃冰箱保存备用。使用前，取出保存的病原菌斜面，于超净工作台上用无菌接种环刮取适量孢子，转移至装有无菌水的小试管中，在Olympus光学显微镜(日本奥林巴斯有限公司)下用血球计数板计数，用无菌水将病原菌孢子浓度调配为1×104spores·mL-1，待用。

1.2.4 樱桃番茄产量及品质测定 待处理组和对照组果实商业成熟期开始测产，总产量为第一穗果始收至最后一穗果终收(7月初)的所有果实的累计重量，5株累计测产，3次重复。将每次测得的产量除以果实个数即得单果重。每组分别取8～10个樱桃番茄测定果实品质，3次重复，测定环境温度为20℃。

1.2.5 果实采后自然腐烂试验 印度梨形孢处理组和对照组果实分别采自苗期植株接种印度梨形孢和未接种印度梨形孢的对照植株，各取60个商业成熟且形状、大小、色泽一致、无损伤及无病虫害的果实，不进行清洗消毒，分别置于3个塑料筐中，每框20个果实，用保鲜膜封口，并贮藏在恒温恒湿的贮藏室(温度25℃，相对湿度95%，下同)内。贮藏过程中观察果实的腐烂情况，果实开始发病并有破损即记为腐烂。21 d后记录果实的腐烂率。

1.2.6 贮藏期果实品质及酶活性检测 各取处理组和对照组果实30个，用0.1%次氯酸钠溶液浸泡1 min，再用自来水冲洗干净并晾干，然后分别置于2个塑料筐中，用保鲜膜封口后置于恒温恒湿贮藏室内,每隔5 d检测果实品质(包括可溶性蛋白含量、硬度、维生素C)和过氧化物酶(peroxidase，POD)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase activity，PPO)的活性。

1.2.7 果实采后病原菌抗性试验 印度梨形孢处理组和对照组分别选取60个果实，用0.1%次氯酸钠溶液浸泡1 min，再用自来水冲洗干净，于室温晾干后置于3个塑料筐，每框20个果实。用直径5 mm无菌打孔器在果实赤道部位制造一伤口。在每个伤口接入20 μL浓度为1×104spores·mL-1病原菌孢子悬浮液。果实自然晾干后，用保鲜膜封口置于恒温恒湿贮藏室内，5 d后观察并记录果实腐烂率，2次重复。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 樱桃番茄品质测定 可溶性蛋白含量测定按 Bradford[23]的方法，采用牛血清蛋白制作标准曲线，每处理 3 个平行，每平行取自 6 个果实。采用WYT-4型手持折光仪(泉州中友光学仪器有限公司)测定可溶性固形物含量，每个果实测2次；采用GY-1型硬度计(杭州托普仪器有限公司)测定果肉硬度，每个果实测2次[24]；采用2,6-二氯酚靛酚法测定维生素C含量[25]；采用酸碱中和滴定法测定可滴定酸含量[26]，用0.1 mol·L-1NaOH滴定，结果表示为含苹果酸的百分数(%)。

1.3.2 果实贮藏期酶活性测定 酶的提取和活性测定采用如下方法[26]：称取组织样品0.3 g于研钵中，加入4.5 mL约4℃的50 mmol·L-1含1.33 mmol·L-1EDTA和1% 聚乙烯吡咯烷酮的 pH值7.8的磷酸缓冲盐溶液缓冲液，加少量石英砂于冰浴中碾磨，于SIGMA 3K-15离心机(德国希格玛公司)离心10 min(4℃、12 000 r·min-1)。 取上清液置于冰浴中用于测定酶活性和可溶性蛋白含量。POD活性采用愈创木酚法[27]测定，以每分钟上升0.01为一个酶活性单位，用U·g-1FW表示。PPO活性采用邻苯二酚法[28]测定，以每分钟上升0.01为一个酶活性单位，以U·g-1FW表示。

1.4 数据分析

采用SPSS 15.0软件进行统计分析，采用One-way ANOVA进行显著性分析(P<0.05)，采用Excel 2010进行作图。

2 结果与分析

2.1 印度梨形孢对樱桃番茄单果重和产量的影响

由图1可知，在樱桃番茄生长前期，接种印度梨形孢植株上果实的单果重比对照增加了14.0%，达显著水平；但在樱桃番茄生长后期，两者无显著差异。另外，由图2可知，接种印度梨形孢植株上果实的产量与对照组无显著差异(P>0.05)。

注：*表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Note: * indicates significant difference among treatments at 0.05 level. The same as following.图1 印度梨形孢对樱桃番茄单果重的影响Fig.1 Effect of P.indica on the weight of single fruit

图2 印度梨形孢对樱桃番茄产量的影响Fig.2 Effect of P.indica on the yield of fruit

2.2 印度梨形孢对樱桃番茄果实品质的影响

由表1可知，苗期植株接种印度梨形孢的果实硬度、总可溶性固形物含量和可滴定酸含量均与对照组无显著差异，但果实的可溶性蛋白含量和维生素C含量均显著高于对照组，可见苗期接种印度梨形孢能显著提高樱桃番茄的果实品质。

表1 印度梨形孢对樱桃番茄品质的影响Table 1 Effects of P. indica on the quality of cherry tomato

2.3 印度梨形孢对樱桃番茄果实自然腐烂率的影响

由图3可知，在室温贮藏21 d后，对照组果实的腐烂率为37.5%，苗期接种印度梨形孢的处理组果实的腐烂率为12.5%，处理组果实腐烂率比对照组降低了25.0个百分点，达显著水平。

图3 印度梨形孢对果实自然腐烂率的抑制效果Fig.3 Effect of P. indica on the fruit of natural decay rate

2.4 印度梨形孢对樱桃番茄果实采后病原菌抗性的影响

由图4可知，苗期接种印度梨形孢能够诱导樱桃番茄果实对链格孢(A.alternata)和灰葡萄孢(B.cinerea)的抗性，果实黑斑病和灰霉病的发病率分别比对照降低了20.0和17.5个百分点，均达显著水平。

图4 印度梨形孢对果实发病率的影响Fig.4 Effects of P. indica on disease incidence of fruit

2.5 印度梨形孢对樱桃番茄贮藏期酶活性的影响

由图5可知，在樱桃番茄果实贮藏过程中，印度梨形孢处理组果实的POD和PPO活性在贮藏11 d时达到峰值，且显著高于对照；对照的POD和PPO活性一直呈下降趋势。可见，印度梨形孢能诱导果实POD和PPO的活性。

2.6 印度梨形孢对樱桃番茄贮藏期间果实品质变化的影响

由图6可知，在樱桃番茄贮藏过程中，果实可溶性蛋白含量、维生素C含量和硬度均逐渐下降。在贮藏第1和第6天时，印度梨形孢处理组的果实可溶性蛋白含量和维生素C含量均显著高于对照；在贮藏第6和第11天时，印度梨形孢处理组的果实硬度显著高于对照。

图5 印度梨形孢对果实贮藏期POD和PPO活性的影响Fig.5 Effect of P. indica on POD and PPO activities of fruit during storage

图6 印度梨形孢对果实贮藏期品质变化的影响Fig.6 Effect of P.indica on the change of fruit quality during storage

3 讨论

王凤让等[29]研究表明，苗期接种印度梨形孢的番茄果实总重量显著高于对照，其原因是接种印度梨形孢提高了番茄植株坐果率，但单果重未提高。本研究结果与之不同，接种印度梨形孢后樱桃番茄果实总产量与对照无显著差异，可能是由于本研究考察的是樱桃番茄全生育期的产量，樱桃番茄是长季节作物，印度梨形孢于定殖前期在其根部进行活体营养生长，能促进根系生长和植株的营养生长，因而生长前期单果重明显提高，而生长后期，印度梨形孢以寄主植株的根细胞进行腐生，导致其根细胞程序性死亡[30-32]，致使生长后期根的生长不及对照，导致其整个生育期产量并未较对照显著提高。Andrade-Linares等[32]研究也发现，印度梨形孢定殖前期番茄产量显著提高，但10周后产量与对照无显著差异。

对果实品质进行分析表明，印度梨形孢处理能提高果实的品质，主要体现在果实中与抗性相关的可溶性蛋白含量和与抗氧化抗衰老相关的维生素C含量高于对照，这与在芹菜[33]上的研究结果相似。并且果实中可溶性蛋白和维生素C含量在贮藏前期显著高于对照，说明苗期植株接种印度梨形孢，可在一定程度上延缓采后果实的成熟衰老进程；另外，果实硬度下降的速度也比对照缓慢，说明苗期接种印度梨形孢能降低贮藏期果实的软化速度。

果实的采后抗性主要表现为对常见病原菌的抗性，樱桃番茄采后常见病原菌包括链格孢和灰葡萄孢。本研究结果表明，苗期樱桃番茄植株接种印度梨形孢，能诱导果实对采后病原菌链格孢和灰葡萄孢的抗性，并显著降低采后果实的自然腐烂率。印度梨形孢可提高烟草对根部黑胫病和青枯病的抗性[34-35]，显著提高小麦对冠腐病[36]、玉米对根腐病[37]等根部病害的抗性，同时也能提高拟南芥叶部白粉病和番茄叶部黄萎病的抗性[18,38]。印度梨形孢可通过诱导与抗性相关基因的表达和激活抗性相关酶的活性，提高植物对病原物的抗性[16,18,24,36-37]。印度梨形孢诱导烟草对黑胫病和青枯病、拟南芥对叶部白粉病的抗性及感病番茄品种对TYLCV的抗性均与提高抗性相关基因的表达和诱导抗性相关酶的活性密切相关[22,34-35,38]。在樱桃番茄果实室温贮藏试验中还发现，贮藏第10天时，对照果实开始发病腐烂，而处理组果实贮藏第16天才发病，且对照果实的腐烂率显著高于处理果实，这一现象刚好与处理果实贮藏中期POD和PPO活性被激活相符。前期已有研究表明，印度梨形孢能够诱导番茄叶部抗性相关基因的表达[22]，印度梨形孢是否能诱导采后果实抗性及成熟软化相关基因的表达以及可能的信号通路将是下一步的研究任务。

4 结论

研究表明，苗期樱桃番茄植株接种印度梨形孢对樱桃番茄总产量无显著影响，但能够提高樱桃番茄果实的品质，延缓果实品质下降的速度，降低果实自然贮藏条件下的腐烂率，并对采后病原菌链格孢和灰葡萄孢有较好的抑制作用。其可能的作用机制包括提高了果实的采后品质，降低了果实软化速度及延缓了果实成熟衰老的进程，并激活了贮藏期间与抗性相关的酶包括POD和PPO的活性。综上，苗期接种印度梨形孢能有效提高樱桃番茄果实品质和采后抗性。