抗菌肽在牙本质粘接剂中应用的研究进展

冯杉杉，金毅夫，陈 欢，侯妍妍，丁景瑜，朱 松

口腔粘接剂与牙体组织牢固的结合,是修复体发挥功能,保证粘接耐久性的前提[1]。在酸蚀-冲洗粘接过程中,牙本质粘接剂未能充分渗透脱矿牙本质基质层,实现对混合层底部脱矿的胶原纤维有效完整的包裹与保护,获得理想质量的混合层[2]。牙本质粘接界面处无法形成长期有效的边缘封闭，产生微渗漏,细菌进入后引起继发龋,最终导致粘接失败。

目前通过采用湿粘接[3]、添加胶原纤维交联剂[4]等减少粘接界面降解的方法使牙本质即刻粘接强度有了很大的提升,但这些方法仍然无法消除混合层的固有缺陷。为提高牙本质-树脂界面的稳定性,具备抗龋功能的牙本质粘接剂成为研究的热点。阳离子抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)作为广谱高效抗菌活性多肽,可以干扰致龋菌在生物膜中的粘附和定植，破坏生物膜的完整性，其独特的抗菌机制和潜在的低诱导细菌耐药性[5]使其在改性牙本质粘接剂中具有良好的应用前景。本文将从AMPs的种类、抗菌机制、在牙本质粘接剂中的应用及防龋效果等方面展开介绍。

1 AMPs的抗菌作用机制

氯己定、季铵盐、三氯生等可以有效抑制致龋菌并控制菌斑生物膜的形成[6-8],长期应用可能会使致龋菌耐药,破坏口腔的稳态,引起微生态失调, 难以提供长期有效的抗菌性，并对口腔健康造成不利影响[9]。AMPs，尤其是阳离子两亲性α-螺旋肽，能够有效地抑制浮游细菌的生长和菌斑生物膜的形成，在诱导现有的生物膜溶解方面具有较高的生物活性[10]。

AMPs经典的非特异性作用机制可以概括为细胞膜靶向机制和非膜靶向机制[11-12]。前者AMPs通过初始的静电作用和(或)疏水作用在细菌细胞膜上聚集,达到一定的阈值浓度后在其表面进行自组装,破坏细胞膜的稳定性,形成跨膜孔道,导致细胞质泄漏、膜电位的去极化和膜功能障碍,最终使细胞裂解死亡[10,13-14]。后者AMPs可以穿过细胞质膜与细胞内靶点作用,通过抑制DNA、RNA的合成,干扰蛋白质的翻译和阻碍细胞壁的合成等途径杀灭细菌[15]。

2 AMPs在改性牙本质粘接剂中的应用

AMPs主要通过物理混合吸附或者化学共价结合的方法与牙本质粘接剂结合,并借非特异性靶向作用机制杀灭细菌。根据AMPs的功能可以将改性的牙本质粘接剂分为抗菌牙本质粘接剂和兼具抗菌和促矿化效果的双功能牙本质粘接剂。

2.1 抗菌牙本质粘接剂

天然的AMPs结构-功能的结构关系复杂,AMPs抗菌性能具有不稳定性，因此无毒、高效、稳定的AMPs是目前临床迫切需要的。为进一步优化其物理化学性能和抗菌性能,学者们合成天然AMPs的类似物或部分片段,并通过修饰氨基酸序列以提高AMPs的生物活性,优化合成肽的功能[16]。目前有研究显示单一赖氨酸、Reuricin-6和Gassericin A的衍生肽LR-10和LN-7、乳酸链球菌素(Nisin)和GH12等已开始用于改性牙本质粘接剂。

2.1.1 Reuricin-6和Gassericin A的衍生肽 Reuricin-6和Gassericin A是由口腔中乳杆菌分泌的环状细菌素,能有效抑制变异链球菌的生长及其生物膜的形成[17]。因其具有较长的环状结构,合成复杂且成本较高，有研究从Reuricin 6或Gassericin A的阳离子α-螺旋区域截断的LR-1(ATGTARKLLDAMA-NH2),构建了10种新的具备阳离子性和疏水性的短线增强AMPs[18-19]。实验结果显示,LR-10(LRWWLWKLLRRMR-NH2)在抑制生物膜的生长和对变异链球菌杀菌效果方面呈剂量和时间依赖性、对口腔生理条件的耐受性强、生物安全性高[19]。

此外,有学者指出,AMPs螺旋成分的百分比>80%,对其抗菌性能有影响[20]。对此,有研究者对LR-1进行氨基酸替换和结构修饰合成LN-7(LRRWLRWLLRWMR-NH2),通过圆二色谱分析测定,LN-7中α-螺旋结构的比例为99.6%,并结合抗菌实验验证具有高螺旋组成LN-7具备良好的抗菌活性[19]。将STAMP中靶向变异链球菌的功能结构域与LN-7、LR-10整合[21],并将整合后的AMPs物理混合到牙本质粘接剂中[10]，以提高其对致龋菌细胞膜的靶向选择性。

2.1.2 抗菌肽GH12 GH12(GLLWHLLHHLLH-NH2) 是一种两亲性阳离子AMPs，具有高比例的α-螺旋结构和平衡的参数结构[22]。体内和体外实验研究都表明GH12在唾液中保持稳定，具有快速和强大的抗菌活性，此外，GH12具有浓度依赖性，64 mg/L的GH12处理后的生物膜呈现松散、平坦和多孔样形态，可显著破坏生物膜的形态和结构的完整性[22]。研究发现GH12具有智能酸活化防龋的能力，酸性pH不影响GH12的二级结构，促进GH12在阴离子细菌膜上的累积，增强与细菌膜的相互作用，诱导生物膜基质降解，提升对细菌的杀伤力[23-24]。当口腔中致龋病原菌生长积累,pH下降时,被组氨酸修饰的GH12可以增强细菌细胞膜的通透性和胞膜的溶解活性[24-25],有选择地杀死预先定植在牙菌斑中的致龋菌,抑制各种毒力因子作用,调节致龋条件下牙菌斑中的不良微生物生态环境[22,26-27],降低龋齿的发生率。

GH12及其衍生物可与牙本质粘接剂Single Bond 2共聚结合[28]。但AMPs存在有限的最佳活性构象, AMPs与聚合物之间的非特异性相互作用会限制肽的生物活性, 降低AMPs的抗菌性能[29]。粘接剂中的AMPs固化后会失去部分活性，学者在AMPs上设计间隔域,提供灵活性构象, 使抗菌肽在与粘接剂共聚结合后仍可发挥最佳抗菌生物活性[30-31]，保证粘接剂的远期抑菌效果。添加单一赖氨酸还可以调节粘接剂的酸碱度,克服粘接界面处酸性微环境的不利影响,提高粘接的耐久性[32]。有研究者尝试将ε-聚赖氨酸添加到牙本质粘接系统中与共聚单体偶联,并依据ε-聚赖氨酸中α-NH2可以与共聚物中的—COOH反应形成多肽单体的原理,设计出GH12,GH12-M1(K_GGGSG_GLLWHLLHHLLH)和GH12-M2(GLLWHLLHHLLH_GSGGG_K)3种多肽单体进行对照实验研究,其中GH12-M1包括一个间隔域,在N端有一个单一的赖氨酸残基,用于偶联到聚合物上,GH12-M2具有与GH12-M1相同间隔区序列,但是将单一的赖氨酸残基放置在肽的C—末端,最终实验证实GH12-M2具有更优异的抗菌功效和灵活性,可以直接地偶联到粘接剂配方中[29]。目前尚未开发出与牙本质粘接剂结合的理想的共聚单体——不降低AMPs的生物活性和保持牙本质粘接剂所需的性能[33],但利用AMPs对复杂牙菌斑生物膜的有效作用机制,探索如何维持AMPs的抗菌调控机制的长期敏感性是十分有必要的。

2.1.3 乳酸链球菌素(Nisin) Nisin是一种由乳酸链球菌产生的具有高效的抗菌活性小分子多肽，其抗菌活性不受唾液中的酶、蛋白质或其他无机成分的影响[34]。在低pH环境中，Nisin的稳定性更高，在粘接界面溶解吸附能力增强，其对致龋菌的抑制作用更明显[35]。

体外实验研究显示在光固化的牙本质粘接剂中Nisin能长期存在于粘接界面，抑制变异链球菌的生长，且随着Nisin浓度的增加，抑制作用增强[36]。在自酸蚀和酸蚀-冲洗模式下，1%～3%Nisin都不会对Single Bond Universal粘接强度产生不利影响，其中含有3%Nisin粘接剂对变异链球菌单种生物膜和唾液衍生多物种生物膜的生长的抑菌效果最好[36-37]。

尽管粘接剂中Nisin可以抑制多种细菌的共聚，但是还需要对继发龋动物模型进行体内研究及体外实验，进一步研究粘接剂固化后影响Nisin活性的因素，以提升Nisin抗菌敏感性和稳定性。

2.2 双功能牙本质粘接剂

龋损是牙体硬组织脱矿和再矿化之间动态失衡造成的，具备再矿化功能的AMPs可以充当异质成核位点,或通过与晶体表面相互作用在粘接界面处作为模板,形成晶体的成核和成长过程[38]。粘接剂中的AMPs可以促进存在缺陷的混合层再矿化,提高粘接界面的封闭性和完整性，优化粘接界面处的即刻和远期修复效果。

据报道,磷蛋白和磷酸肽能促进矿化,磷酸丝氨酸(phosphoserine,Sp)是其中的关键部分,它与羟基磷灰石(HA)结合,并吸引游离钙离子(Ca2+)作为核心启动矿化[39-40]。Zhou等[41]在能够杀死包括变异链球菌在内的多种细菌和真菌的唾液抗菌肽Histatin 5(H5)的N-端枝接了Sp,构建了具有生物活性的Sp-H5分子,使其成为一种兼备抗菌和再矿化性能的生物活性抗菌肽,可安全用于龋齿的预防和有效促进龋损原位自愈。

有研究显示，不同序列和空间构象、两亲性、阳离子性、极性角等会赋予AMPs不同的抗菌效果[44]。因此AMPs的抗菌性能不仅取决于较强的α-螺旋构象，还取决于适当的疏水性和阳离子平衡和最佳的两亲性结构。

3 总结与展望

尽管近年来AMPs改性的牙本质粘接剂已经取得一定的进展，粘接界面处的边缘封闭性增强抗菌效果显著提升，适当添加AMPs对于粘接剂的远期粘接效果和机械性能影响较小。但是AMPs在牙本质粘接剂中的应用仍然存在一些问题,如需进一步评估AMPs的生物分子特征和功能特性的关系，调整AMPs的结构和功能，降低其细胞毒性，抑制致龋生物群的生长，优化抗菌性能；明确AMPs与牙本质粘接剂构建过程的复杂机制及需添加AMPs的安全有效浓度；研究证明二者结合的稳定性以及一些添加抗菌肽的粘接剂对宿主细胞是否可能引起不必要的促炎反应等。

阳离子抗菌肽的化学和物理稳定性很可能会受到外界因素的影响，如温度和pH，从而缩短抗菌活性的时间。如何调整AMPs的浓度，协调固化后的粘接剂稳定持久的抗菌活性、粘接的耐久性和粘接强度之间的平衡状态,保证材料的机械性能，切实提升粘接修复的远期效果，也是未来我们需要不断努力和探索的方向。