有氧运动对尼古丁戒断小鼠VTA多巴胺神经元抑制性突触传递效能的影响

吉春燕,汪澳哲,吕媛媛,赵丽,2,李岩,2*

(1. 北京体育大学运动人体科学学院,北京 100084;2. 北京体育大学运动与体质健康教育部重点实验室,北京 100084;3. 北京体育大学中国运动与健康研究院,北京 100084)

吸烟会增加罹患心脑血管疾病、呼吸系统疾病、精神障碍、恶性肿瘤等多种疾病的发病率,每年导致全球800多万人死亡,给全世界造成巨大的经济压力和社会负担[1]。烟草依赖的主要原因是尼古丁成瘾,其主要特征有:用药后的欣快感、撤药后的戒断症状以及对药物持续性的强烈渴求[2]。复吸是治疗成瘾最大的难题。目前国际平均药物复吸率近91%,我国药物复吸率为90%[3]。戒断过程中患者会因为突然缺失药物出现戒断症状,包括食欲增加、心率降低等躯体症状和焦虑、快感缺失、认知障碍和工作记忆障碍等情感症状[4]。戒断症状引起的强烈渴求是导致戒烟者复吸率居高不下的重要原因,探究戒断期中枢神经系统的变化,寻找引发强烈药物渴求的中枢机制进而降低复吸率,是治疗和控制成瘾性疾病的重要策略[5]。

由中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)的多巴胺(dopamine,DA)神经元投射至伏隔核(nucleus accumbens,NAc)的奖赏环路的结构异常和功能紊乱是导致成瘾形成和戒断后复吸的重要原因[6]。在成瘾形成过程中,各类成瘾性药物直接或者间接地增强VTA的多巴胺神经元在其下游脑区的多巴胺释放,使机体产生强烈的欣快感和正性强化作用从而启动成瘾[7]。在戒断过程中,VTANAc的多巴胺投射会发生相反的变化。戒除各种成瘾药物会导致NAc基础多巴胺的减少[8],从而引起快感缺失等负性情绪反应并激发药物渴求。多巴胺的释放受到神经元兴奋水平的影响,吗啡、尼古丁戒断后VTA多巴胺神经元放电频率均出现降低[9],从而使NAc多巴胺末梢释放的递质减少。多巴胺神经元放电的频率和模式受到γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid,GABA)能抑制性突触传入的严格调控[9]。VTA多巴胺神经元接受来自局部GABA能中间神经元和外部NAc、腹侧苍白球和腹侧背盖区尾侧(the tail of the VTA,tVTA)脑区的GABA能输入。关于抑制性输入在戒断期多巴胺神经元兴奋性变化中的作用机制,有以下3个方面证据[10-12]:第一,药物戒断期,VTA局部兴奋性和抑制性神经递质失衡,表现为GABA增多而谷氨酸减少;第二,电生理学研究表明药物戒断导致VTA区多巴胺神经元抑制性突触传递效能增强;第三,通过光遗传等方法减弱VTA区多巴胺神经元的抑制性突触传递效能可以改善成瘾模型的戒断症状、减少复吸。以上诸多证据表明,药物戒断会导致VTA区多巴胺神经元抑制性突触传递效能增强,从而降低多巴胺神经元的兴奋性,减少NAc多巴胺的释放,触发觅药行为。由此可见,靶向干预VTA区多巴胺神经元相关抑制性投射环路的传递效能是改善戒断症状、减少复吸的重要策略。

流行病学及临床研究证实,运动在药物成瘾的各个阶段都具有保护作用。研究表明,戒断阶段进行运动干预能减轻焦虑、情绪低落、抑郁等负面情绪反应,缓解戒断症状并减少复吸[13]。动物研究发现,持续60 min的运动2 h后,海马的多巴胺释放增加2倍[14]。相关研究表明,运动缓解负性情绪、改善戒断症状、减少复吸可能与运动促进多巴胺代谢有关[15]。但是,目前关于运动促进成瘾戒断期多巴胺释放的神经生物学机制尚不明确,尤其是从功能学的角度探究运动对成瘾戒断期VTA区多巴胺神经元接受的抑制性输入的影响更未见报道。因此,本研究观察有氧运动对尼古丁戒断模型VTA多巴胺神经元GABA能输入的调节作用,以期从突触可塑性的角度为运动减少尼古丁复吸提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本实验以8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠为研究对象,共40只,体重约为22 g,实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2021-0006】提供。动物房内的光照时间由人工控制,白天时间为6:00 ~ 18:00,环境温度为22 ~ 24℃,相对湿度维持50% ~ 65%,饲养于北京体育大学动物房【SYXK(京)2021-0053】。饲养期间,所有小鼠自由摄食及饮水,维持饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。本研究实验方案已获得北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准(2019031A)。

1.1.2 主要试剂与仪器

尼古丁酒石酸盐(Tocris Bioscience,美国),CNQX(Sigma,美国),河豚毒素(Sigma,美国),小鼠单克隆谷氨酸脱羧酶67(glutamic acid decarboxylase 67,GAD67)抗体(Millipore,G5419,美国),荧光素Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG(Invitrogen,A-11032,美国)。

条件性位置偏爱行为学系统(泰盟,CPP-100,中国),动物跑台(杭州段氏DSPT-215,中国),振动切片机(LEICA,VT1200S,德国),膜片钳放大器(Axon,700B,美国),数模模数转换器(Axon,1440A,美国),膜片钳数据采集分析软件(Axon,pClamp 10.7,美国),冰冻切片机(LEICA,CM3050S,德国),激光共聚焦显微镜(LEICA,SP8,德国)。

1.2 方法

1.2.1 成瘾模型建立与运动方案

在适应环境1周后,将小鼠随机分为生理盐水+安静组(saline sedentary组,SS组)、生理盐水+运动组(saline exercise组,SE组)、尼古丁+安静戒断组(nicotine sedentary组,NS组)、尼古丁+运动戒断组(nicotine exercise组,NE组)。采用条件性位置偏爱实验(conditioned position preference,CPP)建立小鼠尼古丁成瘾模型。CPP实验由以下环节组成[16]:(1)预测试(第1天):小鼠被允许自由探索黑箱与黑白条纹箱20 min并记录其在两侧箱体所停留时间,剔除单侧停留时间> 65%的小鼠。(2)条件化训练(第2 ~ 9天):小鼠接受生理盐水或尼古丁给药。在第2、4、6、8天NS、NE组小鼠腹腔注射尼古丁(0.5 mg/kg),放入黑箱20 min;在第3、5、7、9天小鼠腹腔注射等量生理盐水并放入黑白条纹箱20 min。SS、SE组小鼠每天腹腔注射生理盐水并放入对侧箱体训练。(3)测试(第10天):允许各组小鼠在两侧箱体自由探索20 min,记录小鼠在两个箱体中的停留时间。之后停止给药,SE组和NE组小鼠进行连续2周的运动干预,SS组和NS组小鼠自由进食及饮水不进行运动干预。(4)后测:2周戒断后,各组小鼠再次进行CPP测试,方法如测试期,记录小鼠在两侧箱体停留时间。CPP得分(s)为小鼠在注射尼古丁训练箱的停留时间减去注射生理盐水训练箱的停留时间。实验流程如图1。

图1 实验流程图Figure 1 Timeline of the experiments

实验的运动方案:使用跑台进行运动干预,小鼠运动强度为60% ~ 75%最大摄氧量,训练前10 min跑速为12 m/min,后50 min跑速为15 m/min,跑台坡度为0°,60 min/d,每周5 d。课题组前期研究发现该运动强度具有调节突触可塑性的作用[17],前期研究也发现65% ~ 70%最大心率的中等强度运动可以有效降低成瘾患者的主观渴求度[18]。

1.2.2 脑片膜片钳实验

小鼠麻醉(吸入异氟烷),取脑后振动切片,保留含有VTA的脑片,脑片厚度为250 μm。胆碱切片液配方为:23 mmol/L NaHCO3,2.5 mmol/L KCl,1.25 mmol/L NaH2PO4,0.5 mmol/L CaCl2,7 mmol/L MgSO4,10 mmol/L 葡萄糖,11.6 mmol/L 抗坏血酸钠,3.1 mmol/L 丙酮酸钠,110 mmol/L 氯化胆碱,20 mmol/L阿托品。脑片在人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中室温孵育1 h以上,ACSF配方为:2.5 mmol/L KCl,2.5 mmol/L CaCl2,1.25 mmol/L MgCl2,1.25 mmol/L NaH2PO4,119 mmol/L NaCl,23 mmol/L NaHCO3,10 mmol/L葡萄糖,之后进行脑片膜片钳记录。

采用全细胞电压钳技术记录以下指标:自发性抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynaptic current,sIPSC)、微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic current,mIPSC)和抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic current,IPSC)配对脉冲刺激比值(paired-pulse ratio,PPR)。记录用玻璃微电极内充灌电极内液,配方为:100 mmol/L K-gluconate,50 mmol/L KCl,2 mmol/L MgCl2,10 mmol/L Hepes,0.2 mmol/L EGTA,2 mmol/L Mg-ATP,0.3 mmol/L Na2GTP,10 mmol/L磷酸肌酸钠;使用KOH调节pH = 7.2 ~ 7.4。记录诱发指标时,刺激电极置于多巴胺神经元突触前150 μm左右位置,用两个连续刺激诱发PPR(刺激间隔时间:20,50,100,200,400 ms)。整个记录过程,将膜电位钳制在-70 mV,灌流液中加入AMPA受体拮抗剂CNQX(20 μmol/L)阻断兴奋性突触活动。记录mIPSC时,灌流液中加入河豚毒素(tetrodotoxin,TTX,1 μmol/L)阻断动作电位。

1.2.3 免疫荧光染色

小鼠经异氟烷吸入麻醉,灌注4%多聚甲醛进行前固定,取脑置于4℃多聚甲醛后固定24 h,蔗糖脱水后,使用冰冻切片机进行冠状切片,脑片厚度40 μm。切片经封闭后加入GAD67抗体(1∶200),4℃孵育48 h,室温孵育Alexa Fluor 594标记的二抗(1∶600)1 h。使用荧光封片剂(DAPI)封片,激光共聚焦显微镜拍照。免疫荧光图片处理使用Image J软件进行半定量分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,实验结果以平均值 ± 标准误差(±)表示。使用Clampfit软件导出sIPSC和mIPSC,再使用Minianalysis软件分析平均频率和平均幅度。使用pClamp 10.7 软件采集并分析诱发的突触后电流数据IPSC PPR。使用Image J软件分析免疫荧光图片的荧光强度。本研究数据在满足方差齐性检验的条件下,进行双因素方差分析(Two-way ANOVA),采用Holm-Sidak法进行多重比较。统计学显著性水平为P< 0.05。

2 结果

2.1 有氧运动对尼古丁戒断小鼠复吸行为的影响

CPP得分的双因素方差分析结果(见图2)显示尼古丁戒断和有氧运动对CPP得分有显著交互效应(P< 0.05)。与SS组相比,NS组得分显著升高(P< 0.05);与NS组相比,NE组得分显著降低(P< 0.05)。以上结果提示,有氧运动改善尼古丁戒断小鼠的条件性位置偏爱,即有氧运动减少尼古丁成瘾小鼠戒断期的复吸行为。

图2 各组小鼠CPP得分Note. A. Timeline of CPP paradigm. B. CPP scores of mice in each group. Compared with the SS group, *P < 0.05. Compared with the NS group, #P < 0.05. (The same in the following figures)Figure 2 CPP score of mice in each group

2.2 有氧运动对尼古丁戒断小鼠VTA多巴胺神经元sIPSC的影响

各组小鼠sIPSC记录原始图见图3A。对sIPSC的平均频率和平均幅度进行双因素方差分析(图3B,3C),结果显示尼古丁戒断和有氧运动的交互效应显著(平均频率,P< 0.05;平均幅度,P< 0.05)。多重比较结果显示,与SS组相比,NS组sIPSC的平均频率(P< 0.001)和平均幅度(P< 0.01)显著升高;与NS组相比,NE组sIPSC的平均频率(P< 0.01)和平均幅度(P< 0.001)显著降低。以上结果提示,尼古丁戒断增强VTA多巴胺神经元接受的GABA能输入;有氧运动使尼古丁戒断小鼠VTA多巴胺神经元接受的GABA能输入降低。

图3 各组小鼠VTA多巴胺神经元sIPSCNote. A. Representative sIPSC traces recorded by patch clamp. B. The mean frequency of sIPSC in these four groups. C. The mean amplitude of sIPSC in these four groups. Compared with the SS group, **P < 0.01, ***P < 0.001. Compared with the NS group, ##P < 0.01, ###P < 0.001.(The same in the following figures)Figure 3 sIPSC from VTA dopamine neurons of mice in each group

2.3 有氧运动对尼古丁戒断小鼠VTA多巴胺神经元mIPSC的影响

GABA能输入的变化可能由动作电位驱动突触前GABA释放增加和/或突触前囊泡随机释放增加所致。本研究为探究其可能机制,在人工脑脊液中加入TTX,阻断动作电位,记录由突触前囊泡随机自发地释放GABA所产生的抑制性突触后电流。各组小鼠mIPSC记录原始图见图4A。对mIPSC的平均频率和平均幅度进行双因素方差分析(图4B,4C),结果显示尼古丁戒断和有氧运动的交互效应显著(平均频率,P< 0.05;平均幅度,P< 0.05)。

图4 各组小鼠VTA多巴胺神经元mIPSCNote. A. Representative mIPSC traces recorded by patch clamp. B. The mean frequency of mIPSC in these four groups. C.The mean amplitude of mIPSC in these four groups.Figure 4 mIPSC from VTA dopamine neurons of mice in each group

多重比较结果显示,与SS组相比,NS组mIPSC的平均频率(P< 0.05)和平均幅度(P< 0.05)显著升高;与NS组相比,NE组mIPSC的平均频率(P< 0.05)和平均幅度(P< 0.05)显著降低。

sIPSC和mIPSC的结果提示,尼古丁戒断导致VTA多巴胺神经元突触前的GABA以动作电位触发和随机自发的机制释放增加,突触后GABAA受体数量增多和/或功能增强,从而增强抑制性突触传递效能;有氧运动减少尼古丁戒断小鼠VTA多巴胺神经元突触前动作电位驱动的GABA释放和随机自发的GABA释放,下调突触后GABAA受体数量和/或功能,从而减弱抑制性突触传递效能。

2.4 有氧运动对尼古丁戒断小鼠VTA多巴胺能神经元IPSC PPR的影响

由于sIPSC和mIPSC幅度的变化可能导致频率变化,因此单纯通过sIPSC和mIPSC的频率与幅度判断抑制性传递突触前和突触后机制的变化具有一定局限性[19]。为了进一步区分抑制性突触传递效能的变化是突触前还是突触后的效应,本研究检测了VTA多巴胺神经元的抑制性突触后电流(IPSC)配对脉冲比(PPR = IPSC2/IPSC1),以此反映多巴胺神经元的突触前抑制性递质释放概率。各组小鼠诱发的IPSC记录原始图见图5A。对在20 ms、50 ms、100 ms和200 ms刺激间隔记录的IPSC PPR分别进行双因素方差分析,结果显示在20 ms(图5B)和50 ms(图5C)刺激间隔时,尼古丁戒断和有氧运动的交互效应显著(20 ms,P< 0.05;50 ms,P< 0.05);在100 ms和200 ms刺激间隔时,尼古丁戒断和有氧运动的交互效应不显著(P> 0.05)。多重比较结果显示,在20 ms和50 ms刺激间隔时,同SS组相比,NS组IPSC PPR显著降低(20 ms,P< 0.01;50 ms,P< 0.01);同NS组相比,NE组IPSC PPR显著升高(20 ms,P< 0.01;50 ms,P< 0.05)。其它刺激间隔时各组间IPSC PPR均无显著性差异(P> 0.05,图5D,5E)。以上结果提示,尼古丁戒断增强VTA多巴胺神经元突触前GABA释放概率;有氧运动降低尼古丁戒断诱导的VTA多巴胺神经元突触前GABA释放概率。

图5 各组小鼠VTA多巴胺神经元IPSC PPRNote. A. Representative IPSC traces at 20 ms interstimulus intervals recorded by patch clamp. B. IPSC PPR at 20 ms interstimulus intervals in these four groups. C. IPSC PPR at 50 ms interstimulus intervals in these four groups. D. IPSC PPR at 100 ms interstimulus intervals in these four groups. E. IPSC PPR at 200 ms interstimulus intervals in these four groups. Figure 5 IPSC PPR from VTA dopamine neurons of mice in each group

2.5 有氧运动对尼古丁戒断小鼠VTA GAD67表达的影响

VTA GAD67免疫荧光染色的效果图见图6A,图中红色荧光为GAD67阳性染色,蓝色荧光为细胞核染色。对VTA中GAD67的荧光强度进行双因素方差分析(图6B),结果显示尼古丁戒断和有氧运动的交互效应显著(P< 0.001)。多重比较结果显示,同SS组相比,NS组的荧光强度显著降低(P< 0.01);同NS组相比,NE 组的荧光强度显著升高(P< 0.001)。以上结果提示,尼古丁戒断下调VTA GAD67蛋白表达;有氧运动上调尼古丁戒断小鼠VTA GAD67蛋白表达。

图6 各组小鼠VTA GAD-67的表达Note. A. Immunostaining of GAD67 in VTA. B. Fluorescence intensity of GAD67 in VTA in these four groups. Figure 6 Expression of GAD67 in VTA of mice in each group

3 讨论

运动干预是一种潜在的治疗和控制成瘾性疾病的新策略,可能发展成为控制成瘾性疾病或毒瘾戒断的独立干预措施或重要辅助方法[20-21],但运动促进成瘾记忆消除、减少复吸的中枢机制远未明了。本研究发现,有氧运动可以减少成瘾模型在戒断期对尼古丁的复吸;有氧运动对尼古丁戒断诱导的VTA多巴胺神经元GABA能抑制性输入异常具有改善作用,即减少突触前GABA释放,下调突触后GABAA受体的数量和/或功能,从而减弱多巴胺神经元接受的抑制性突触传递效能。本研究为运动干预改善成瘾、减少复吸提供了一定的实验依据。

从神经生物学角度来看,成瘾性疾病是一种慢性、高复发性的脑部疾病。戒断后再次复吸是导致成瘾性疾病戒断失败的重要原因,因此减少复吸是治疗成瘾的关键。本研究所使用的CPP模型是一种巴甫洛夫条件反射形式,被认为是评价药物精神依赖的简单有效的方法之一[22]。CPP实验过程中,控制给药与不给药时训练环境的不同,最后在不给药的情况下测试动物是否对给药箱产生偏爱,其对环境的偏爱程度代表动物对药物的渴求与依赖程度。已有文献对不同运动强度和运动方式对药物成瘾复吸渴求度的影响进行了研究。赵琦等[18]的研究发现,中等强度(65% ~ 70%最大心率)和高强度(80% ~ 85%最大心率)运动均能有效降低成瘾患者的主观渴求度。周跃辉等[23]发现中等强度运动通过上调前额叶皮层α7 nAChRs蛋白表达增强尼古丁成瘾大鼠的抑制能力,进而降低尼古丁大鼠的依赖性。Jung等[24]也发现2周中等强度有氧运动改善成瘾模型的行为学变化,其机制与纹状体谷氨酸能突触传递的信号分子表达变化有关。但是信号分子的变化与突触传递的变化并不完全一致,因此以上机制研究并未在功能学层面提供证据。本研究实验结果显示,戒断期2周的有氧运动可以减少小鼠对尼古丁箱体的条件性位置偏爱,表明2周有氧运动可以减少成瘾模型戒断期对尼古丁的复吸,这一结果与前人的研究一致[25-26]。本研究的结果一方面再次证实运动具有减少复吸、改善成瘾的作用;另一方面也说明CPP是研究运动改善成瘾的可靠模型。

GABA能抑制性输入对VTA多巴胺神经元的兴奋性起到重要调控作用[27]。研究发现,VTA多巴胺神经元接受的GABA能突触传递在成瘾形成期和戒断期的变化特征不同。在成瘾的形成期,成瘾物质的暴露以直接或间接的形式减弱GABA能输入,从而使多巴胺神经元“去抑制”,表现为兴奋性过度增强。如吗啡通过与阿片受体结合抑制VTA GABA能神经元兴奋性,从而增加多巴胺水平[28]。而在戒断期间多巴胺神经元接受的抑制性突触传递又表现为相反的效果,即戒断导致GABA能传递增强,从而使得多巴胺分泌减少,最终导致戒断期的负性情绪,触发复吸行为,但这一假设尚缺少充分的功能学证据。Jiang等[29]最新的研究发现,吗啡戒断导致的负性情绪与奖赏环路功能下调有关;使用电生理学手段发现吗啡戒断使得中央杏仁核(CeA)促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)神经元向VTA吗啡奖赏神经元集群的抑制性突触连接增强,而光遗传抑制该神经通路可以缓解戒断模型的药物复吸。本研究发现,尼古丁戒断使VTA多巴胺神经元sIPSC和mIPSC的频率及幅度增加,IPSC PPR降低,表明尼古丁戒断导致VTA多巴胺神经元接受的抑制性传递增强,这种改变涉及突触前与突触后机制,即突触前GABA递质释放概率增加、突触后GABAA受体的数量增加和/或功能增强,本研究结果与前人研究结果一致,从功能学的角度再一次证实VTA多巴胺神经元抑制性突触传递效能增强是导致戒断症状的重要机制。

对戒烟人群的研究发现,运动可以减轻戒烟者戒断期间的焦虑等负性情绪,从而减少复吸[20]。动物实验也发现吗啡戒断期进行运动干预可以减轻戒断模型的焦虑程度和压力状态,缓解戒断症状[30]。已有文献表明,运动可以增加多巴胺释放以弥补药物戒断导致的快感缺失,有利于减轻戒断症状[31]。Kami等[32]的研究发现运动可以增强病理性疼痛大鼠背外侧被盖区和下丘脑外侧区至VTA的投射,增强VTA多巴胺神经元的兴奋性。Medrano等[33]的研究发现运动上调VTA多巴胺神经元AMPA/NMDA ratio,增强兴奋性传递效能。但是运动对VTA抑制性环路的调节作用目前研究较少。本研究发现,有氧运动降低了由尼古丁戒断引起的小鼠VTA多巴胺神经元GABA能输入增强:有氧运动导致成瘾模型戒断期VTA多巴胺神经元sIPSC和mIPSC的频率下降、IPSC PPR比值升高,表明有氧运动降低了突触前动作电位驱动的GABA释放(sIPSC频率降低)和GABA随机自发的释放概率(mIPSC频率降低);同时,有氧运动使sIPSC和mIPSC的幅度显著下降,表明有氧运动下调了突触后GABAA受体的数量和/或减弱了GABAA受体功能。结合本研究行为学的结果,提示有氧运动降低尼古丁戒断模型VTA多巴胺神经元抑制性突触传递效能可能是有氧运动减少尼古丁复吸的中枢机制之一。但本研究对有氧运动改善VTA多巴胺神经元抑制性突触传递效能只有电生理学的证据,并未阐释运动减少突触前GABA释放的分子机制,也未阐明突触后GABAA受体的蛋白表达和亚基组成特征的变化,这是本研究的不足,将在后期研究中进行此方面研究。VTA多巴胺神经元同时接受来自VTA局部GABA能输入和外部脑区(伏隔核、腹侧苍白球、吻内侧被盖核等)的GABA能输入,不同的GABA能投射在药物成瘾形成、戒断等不同阶段的作用机制可能不同,那么运动对多巴胺神经元接受的局部GABA输入和外部GABA输入是否具有不同调节作用?

GAD67是GABA合成的限速酶,主要位于胞浆中,能反应VTA局部GABA能神经元GABA的合成情况,从而间接反应VTA局部的GABA能传递情况。本研究发现,尼古丁戒断使VTA的GAD67表达降低,提示VTA局部GABA能神经元GABA合成减少。结合本研究电生理结果,即尼古丁戒断期间VTA多巴胺神经元抑制性突触传递效能增强,我们推测戒断期VTA多巴胺神经元接受的来自外部脑区的GABA输入增强而VTA局部的GABA输入减弱。尼古丁戒断导致VTA局部GABA能传递减弱可能和以下两方面原因有关:第一,内源性大麻素介导的负反馈调节。前期研究表明,成瘾物质暴露诱导VTA多巴胺神经元过度激活,释放内源性大麻素,与突触前GABA神经元上的CB1受体结合,激活钾离子通道,直接或间接阻滞钙通道,从而抑制突触前神经元GABA的释放[34],推测这种调节递质释放的突触前机制一直持续至戒断期。第二,神经环路之间的调控。VTA接受的外部脑区的抑制性输入,如NAc和喙内侧被盖核(rostromedial tegmental nucleus,RMTg)等,也和VTA局部GABA能神经元形成投射关系。戒断使外部脑区的抑制性输入增强,从而抑制VTA局部的GABA能神经元的递质释放。VTA局部的GABA能神经元兴奋性降低,从而减弱对外侧缰核(lateral habenula,LHb)谷氨酸能神经元的抑制作用,使LHb的谷氨酸能神经元兴奋性增强[35],再通过LHb→RMTg(tVTA)投射增强RMTg的GABA能神经元的兴奋性,进而通过RMTg→VTA环路抑制VTA多巴胺神经元兴奋性[36],减少多巴胺释放,触发复吸,因此推测VTA局部GABA能神经元在通过VTA GABA神经元→LHb→RMTg→VTA多巴胺神经元环路降低多巴胺神经元兴奋性过程中起到“正反馈”(图7),形成恶性循环。Meye等[37]发现成瘾物质导致LHb谷氨酸能神经元兴奋性增强,LHb→RMTg的兴奋性传递增强。Lyu等[38]发现使用药理学手段增加LHb的GABA浓度可以改善帕金森大鼠的抑郁样行为,提示投射至LHb的抑制性输入是导致负性情绪的机制之一。以上研究一定程度上支持本文的推测。本研究发现,有氧运动改善尼古丁戒断导致的VTA GAD67表达降低,提示有氧运动对上述抑制VTA多巴胺神经元的环路具有改善作用。Herrera等[39]研究发现运动增强大鼠NAc的FosB表达,提示运动可能增强NAc的激活程度,进而增强NAc至VTA GABA能神经元的传递效能,因此推测本研究中运动增强VTA GAD67表达是由于增强了NAc等脑区对VTA GABA能神经元的抑制性输入所致。结合电生理学的实验结果,我们推测VTA GABA合成增加,通过VTA-LHb-RMTg-VTA环路增强多巴胺神经元兴奋性,增加多巴胺释放。Kim等[40]的研究发现应激增强LHb的c-fos表达,但中等强度的运动并未增强LHb的c-fos表达,该研究也佐证了本研究的推测,即运动可能抑制LHb谷氨酸能神经元的兴奋性,从而缓解负性情绪。综上所述,本研究的结果提示VTA多巴胺神经元接受的外部脑区抑制性输入和VTA局部的抑制性输入在尼古丁戒断期间变化特征不同,最终共同作用使多巴胺神经元的抑制性传递增强,而运动对此具有改善作用。但本研究使用免疫荧光技术间接反应VTA局部GABA能传递效能,具有一定局限性,这是本研究的不足,后期将会综合使用神经环路示踪技术、光遗传和电生理技术深入研究运动对戒断模型不同神经环路的调控机制。

图7 尼古丁戒断神经环路调控机制假说图Figure 7 Hypothesis of neural circuits in nicotine withdrawal

4 结论

2周的中等强度有氧运动减少尼古丁戒断模型VTA多巴胺神经元突触前GABA释放,下调突触后GABAA受体的数量和/或功能,减弱抑制性突触传递效能,这可能是有氧运动减少复吸的重要机制之一。