孤独症谱系障碍动物模型相关神经生物学研究进展

张雪原,孔亚敏,马丙祥,*,党伟利,周荣易,,史文丽,

(1. 河南中医药大学儿科医学院,郑州 450046;2. 河南中医药大学第一附属医院儿科,郑州 450003)

孤独症谱系障碍(austim spectrum disorder,ASD)是一组神经发育障碍性疾病,其主要特征是社交互动和交流受损、重复、刻板行为和兴趣受限[1]。ASD患者还常伴多种共患病,如智力障碍、言语语言障碍、注意缺陷多动障碍、抽动障碍、睡眠障碍、胃肠道功能障碍、焦虑、癫痫发作等。具有高度致残率,患病率为1% ~ 2.5%,且呈不断上升趋势[2]。因本病为终身性疾病,致患儿难以融入社会,职业和其他功能方面受到影响,给患儿及家庭带来极大困难。ASD的病因错综复杂,目前仍有争论,尚未鉴定出可用于明确临床诊断的标志物。尽管如此,过去几十年的研究已经确定了导致孤独症的各种风险因素,可分为遗传改变(罕见突变、基因变异、缺失、重复、染色体序列重组)和环境暴露(化学品暴露、产前和围产期因素、自然/社会环境)。然而在了解其确切的病理生理学机制和治疗方法方面仍存在不足,因此,有必要通过现有的ASD动物模型进行验证。基于已确定的风险因素和ASD的可能病因,创建了两种主要类型的动物模型模拟和了解这种疾病行为异常的病理机制,分别是病变模型和遗传模型。病变模型包括产前免疫激活、产前感染、产前丙戊酸、丙酸及其他药物暴露。ASD动物模型的种类正在迅速扩大,并且在未来几年将不断增加,但仍需简明扼要地系统性评估其神经生物学意义,这篇综述汇总了ASD病变动物模型具备的神经生物学特性和药理学靶向治疗潜力,为今后开展病理生理学及治疗靶点等研究选取模型提供针对性选择(见表1)。

表1 ASD动物模型构建概况一览表Table 1 Overview of ASD anima model construction

1 丙戊酸(valproic acid,VPA)诱发模型

丙戊酸(VPA)是一种常用的抗惊厥药和情绪稳定剂,可缓解癫痫发作、偏头痛和躁狂发作等。女性在妊娠期使用可能会使后代出现包括脑组织异常、神经管缺陷、智力障碍和认知行为障碍等许多缺陷[3],与后代患ASD的病因和表现出的临床症状具有强烈相关性。从机制上讲,VPA诱导的ASD动物模型增强了Wnt1信号通路的表达,GSK-3β/βcatein通路被激活后并致胚胎脑神经发育增强,降低了IKBα的表达水平并激活了NF-κβ信号通路,从而导致神经延迟发育[4]。这些揭示了ASD中神经前体细胞(neural precursor cells,NPC)增殖和神经元过度生产的潜在的分子途径。还有研究发现,Notch信号通路异常激活,相关分子Notch1、Jagged1、Notch细胞内结构域(notch intracellular domain,NICD)和Hes1表达增加,自噬和树突棘生长调节不良从而致ASD发病[5]。基因研究方面,VPA大鼠大脑内存在较多表达基因及可变剪接基因,这些异常基因与神经系统疾病和神经系统发育有关,影响大鼠的社会行为[6]。研究结果还表明,在ASD模型中,大鼠大脑皮层中的几个谷氨酸能基因与γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能基因表达的平衡变化形成对比[7]。此外,与对照大鼠相比,VPA诱导的大鼠异常社会行为相关基因的mRSA表达显著下调(编码5-HT、脑内神经营养因子、neuriligin3的基因)[8]。脑组织结构上,VPA鼠与对照大鼠脑体积减少,小脑和脑干局灶性灰质密度降低[9],小叶V1体积增加,Ⅰ、Ⅳ、Ⅹ体积减小,这影响认知行为[10]。分子机制方面,VPA诱导的浦肯野细胞(purkinje cell,PC)数量显著减少,在雌雄分别于正中副小叶、小脑后部显著,可能对小脑功能连接的大脑皮质区域产生发育影响[9],因为血氧水平依赖(blood oxygen level dependent,BOLD)反应与PC数量之间正相关[11],导致孤独症中观察到运动障碍和行为异常。而室旁核、脑脊液中的AVPir细胞数量减少,致使与情感和认知方面相关的脑功能减弱[12]。Pax6通过丙戊酸盐暴露在胚胎皮层中短暂增加,导致谷氨酸能蛋白在后代产后脑中的表达增加[13];海马中GABA酶、谷氨酸脱氢酶GAD67蛋白降低,结合社会行为相关基因下调诱导了孤独症样行为[8]。海马组织中Sphk2和S1p上调,影响模型鼠学习及记忆障碍[14]。肝代谢酶下调从而减少血清多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)反应与PC数量之间正相关[11],导致孤独症中观察到运动障碍和行为异常。而小脑胶质增生,进一步致神经系统损伤和行为改变。此外,肠道菌群影响大脑正常功能,肠道菌群失调,粪便微生物丰富度降低、组成改变,粪便微生物群落的代谢潜能改变[15],与孤独症谱系障碍(ASD)患者患有胃肠道疾病的微生物改变表现一致。

VPA诱导的啮齿动物模型目前认为是最适合孤独症的动物模型,也是研究直接或间接参与途径的最有效模型。其模型特点:动物性别、鼠龄使海马兴奋性不同;产前较产后诱导新生鼠死亡率低得多,且ASD核心症状及组织病理学变化更显著;VPA以性别依赖性方式/性别特异性差异导致前额多巴胺系统功能减退;对大脑的影响以特定年龄和特定区域的方式;另外自主神经活动从胎儿期开始就已经发生变化。该模型的主要限制是缺乏行为、结构、功能和认知桥接参数,且在孤独症的遗传领域的研究很少。

2 丙酸(propionic acid,PPA)诱发模型

丙酸(PPA)是一种短链脂肪酸,是肠道微生物组的主要发酵产物,是新陈代谢的正常中间体,存在于天然食物或防腐剂中。PPA和其他短链脂肪酸影响多种生理过程,如细胞信号传导、神经递质合成和释放、线粒体功能,过度暴露可产生类似于孤独症谱系障碍中所展现的大脑、行为变化及神经炎症反应[16]。为了探讨PPA在ASD病因学中的作用,在Wistar大鼠脑室内输注PPA后观察到氧化应激、神经炎症、细胞凋亡和神经递质失衡增强,存在兴趣减少、社交行为减弱、行为重复、焦虑等孤独症样表现。脑脂质谱、脑脂肪酸代谢水平在脑室内输注丙酸之后改变,且总单不饱和物、总ω6脂肪酸、总磷脂酰乙醇胺缩醛磷脂、ω6:ω3比例降低,分离磷脂物种的总饱和水平提高。由于ω6:ω3脂肪酸的严重失衡使得促炎事件的风险增加导致了神经系统疾病,大鼠表现出刻板重复行进运动的频率显著增加。PPA建模有剂量和时间依赖性效应[17]。PPA主要对ASD患者的淋巴母细胞系(lymphoblast cell line,LCL)亚群的线粒体功能产生双向调节作用,具体取决于浓度、暴露持续时间和微环境氧化还原状态[18]。

3 母体免疫激活(maternal immune activation,MIA)模型

MIA由细菌或病毒以不同的方式诱导。细菌内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和合成病毒RNA多肌苷酸:多胞苷酸(Poly I:C)通常用于啮齿动物造模,分别模仿细菌和病毒引起的病理过程。Hameete等[19]提出母体免疫激活可能影响胎儿发育的潜在机制之一可能是胎儿中细胞因子浓度的改变,因为细胞因子在神经和免疫系统的功能和发育中发挥作用。这与Saghazadeh等[20]报道的ASD患者中促炎细胞因子的荟萃分析结果一致。

3.1 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱发模型

脂多糖是在革兰氏阴性细菌外膜中发现的免疫激活剂,可充当内毒素。妊娠期感染LPS(模仿细菌感染)诱发母体免疫激活(MIA)与神经发育障碍密切相关。在胚胎发育后期注射100 μg/(kg·d)的LPS,检测到孕鼠血液中高于正常水平的TNF-α和IL-6可确认免疫激活成功[21]。先前的研究表明,产前暴露于LPS诱导孕母或后代孤独症样行为[22],如焦虑过度、社交互动减少以及学习和记忆受损。产前LPS暴露诱导MIA,母体血清IL-17A、IL-6、IL-17A mRNA表达上调和产生IL-17A的γδ T细胞在子宫富集致后代ASD样行为[23],皮质酮水平升高使胎盘组织受损并导致活胎数减少[24]。注射LPS后,发现幼鼠在神经元发育的关键阶段,Nfe2l2表达上调,增加了Iba1+和CD68+细胞数量,并且显著上调了海马体中的促炎细胞因子基因表达,增加了脑内丙二醛水平。在新生10日龄(PND 10)时,幼崽的超声发声(ultrasound voice,USV)减少,表明诱导促炎反应和氧化应激引发社会沟通障碍并显著降低了前脉冲抑制(pre-pulse inhibition,PPI)[25]。LPS激发的幼年雌性表现出与孤独症相关的最显著的神经生物学改变,例如小胶质细胞激活增加和微清蛋白(parvalbumin,PV)损伤[26]。脑功能障碍与促炎细胞因子的改变以及小胶质细胞的数量和/或形态之间存在相关性。产前LPS诱导孤独症样效应与多巴胺能系统低活性密切相关[27]。LPS模型雌鼠表现出基线运动不足和对苯丙胺的反应性降低,成年后社交能力受损、社会互动减少、记忆力差。而LPS雄性表现出空间学习(获取实验)和记忆(探针实验)障碍[22]。最近报道人类的CX3CR1基因变异导致不规则趋化因子(fractalkine,FKN)信号传导中断与神经发育障碍的风险增加有关。可能解释妊娠晚期的急性免疫损伤可以通过降低小胶质细胞CX3CR1蛋白表达来改变压裂素信号传导,突出神经元-小胶质细胞压裂素信号传导是神经发育障碍环境危险因素所致结果的相关靶标[28]。研究发现,产前、产后LPS暴露免疫激活可能影响大脑回路中不同的细胞靶点[29]。LPS激发新生鼠后,雄性表现抑郁、焦虑、行为重复和工作记忆缺陷;雌性有质子泵抑制剂(proton pumump inhibitors PPI)缺陷,表现出性别差异[30]。新生仔鼠LPS暴露引发类似于孤独症谱系障碍的性别特异性行为和神经化学改变,构成与该疾病发展相关的性别偏见机制调查的相关模型[31-33],还可用于评估炎症反应性对孤独症相关行为的作用。

3.2 多肌苷:多胞苷酸(Poly(I:C))诱发模型

迄今为止,大多数母体免疫激活(MIA)研究都是使用LPS和多肌苷:多胞苷酸(Poly(I:C))在啮齿动物中进行。Poly(I:C)是一种双链RNA,模仿病毒感染可诱导MIA。在怀孕期间注射Poly(I:C)的大鼠的后代表现出与孤独症相关的表型,包括焦虑增加、刻板重复行为、社交互动和沟通减少、社会偏好、前驱抑制受损和感觉运动协调降低[3]。妊娠中期单次皮下注射0.5 mg/kg低剂量的Poly(I:C)虽然对母体、胎儿或新生儿存活或出生后生长发育没有影响,然而,导致胎儿大脑中TNF-α的下调、感觉运动门控异常,后代在非空间记忆和学习任务以及活动方面表现出显著的损害[34]。在怀孕的C57BL6/J小鼠GD 12.5日接受单次注射Poly I:C(20 mg/kg),在MIA后代海马体和小脑两个大脑区域发现神经炎症反应差异与性别显著相关,仅在雌性中观察到促炎因子TNF-α、IL-6和iNOS的显著反应。同时观察到,PND 28时特定微生物群中拟杆菌门的增加和疣状菌门的减少,在青春期和成年早期给予TNF-α抑制剂可缓解接受Poly(I:C)暴露的新生儿质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPI)缺乏[35]。脑组织学检查显示,分泌型糖蛋白reelin显著降低,胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达增加,特别是在海马体中小胶质细胞数量增加。这项研究证明产前亚临床感染可以对大脑发育产生深远影响[36]。不同批次的Poly(I:C)可以诱导不同的免疫反应,并且对母体生理和妊娠结局产生不同的影响[37]。研究提示在使用Poly(I:C)建立MIA模型时考虑所用产品的精确分子组成和免疫原性至关重要,应尽量减少分子量变异性和内毒素污染,以便进行更强大的MIA建模[38]。未来可以建立参考数据库,将表型数据与经验获得的高质量信息相结合,这有助于设计、实施和解释基于poly(I:C)的MIA模型。

4 其他

4.1 博尔纳病毒(borna disease virus,BDV)诱发模型

博尔纳病毒(BDV)是一种高度嗜神经性、非节段性、单股负链的RNA病毒,是一种可传播的、进行性的、致命的病毒,持续性感染许多哺乳动物的中枢神经系统,可引起马和羊的脑脊髓炎,与人类的神经系统损伤和行为障碍有关[3]。有学者提出了两种可能BDV导致神经病理学的新机制,一是异常的胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)信号传导,IGF信号传导被干扰后诱导BDV感染中的浦肯野细胞丢失。另一种是将BDV序列整合到宿主基因组中,BDV整合子可能会使受感染细胞的转录组紊乱,从而影响BDV神经病理学[39]。BDV感染是ASD的第一个病毒诱导的动物模型,Lewis新生大鼠中通过 BDV 颅内接种,产生强大的适应性,可以持续感染中枢神经系统(central nervous system,CNS)的神经元使CNS神经化学递质的发育和区域异常而不会引起一般细胞死亡[40]。然而,BDV感染后,神经元网络活性的活动依赖性增强受到干扰,可能是因为它对蛋白激酶C信号通路的影响[41]。Honda等[42]调研了日本ASD儿童血清中博尔纳病毒抗体阳性的患病率为7.4%,且性别之间无明显差异。此基线数据表明年幼儿童对BDV感染的高易感性,为此后的研究提供了有价值的数据支撑。总体来说,BDV模型独特地结合了系统性脑功能异常(例如:免疫和神经递质紊乱)和选择性损伤(例如:脑病理学和行为缺陷)等特征,可能能够模拟ASD中各种假定的致病过程。BDV模型的未来研究也可能旨在进一步阐明病毒对神经元和神经胶质细胞内分子过程的影响并导致行为缺陷的机制。

4.2 特布他林(trbutaline)诱发模型

特布他林是一种β2-肾上腺素受体激动剂,超适应症用于早产的长期管理,与双卵双胞胎孤独症的一致性增加有关。免疫组织化学研究表明,PN 2至PN 5时皮下注射特布他林可发现PN 30时大鼠大脑皮层以及小脑和脑皮质白质中的小胶质细胞活化强烈增加。在行为测试中,大鼠表现出对新奇和厌恶刺激的高反应模式[43]。Bercum等[44]研究报道出一种新的孤独症和癫痫(epilepsy,EP)联合动物模型,孕鼠在整个怀孕期间受到轻度施压联合幼崽在出生后第2 ~ 5天注射特布他林可导致严重的异常行为症状,以及45%的大鼠自发复发性惊厥发作和100%的癫痫样脑电波。这种ASD和EP联合的新动物模型使得对共患病的细胞机制和潜在干预策略进行实验研究成为了现实。

4.3 米索前列醇(misoprostol)诱发模型

米索前列醇是一种合成的前列腺素E1类似物,高剂量给予孕妇引发子宫收缩可提前终止妊娠,低剂量给予妇女可帮助分娩。早前关于孤独症和妊娠期间使用米索前列醇阳性史的报告结果显示,米索前列醇暴露组孤独症发生率较高,为3/7[45],表现出孤独症特征的儿童的母亲怀孕期间均有流产药物米索前列醇的暴露史[46]。Koenig等[47]研究未发现孕期暴露于米索前列醇40 μg/kg的C57BL/6J小鼠,其后代有显著的ASD样行为和神经功能障碍,大脑形态未受严重影响,海马神经元未见缺损,且米索前列醇可以保护神经并减少几种不同细胞类型的凋亡。总之,目前的结果不能支持孕期暴露米索前列醇对小鼠的神经发育毒性,因此,未来应进行对米索前列醇在包括ASD在内的神经发育障碍的病因学中是否作用及如何作用作进一步探讨。

4.4 沙利度胺(thalidomide,THAL)诱发模型

沙利度胺是一种治疗多种自身免疫性疾病的新型免疫调节药物,最初作为镇静药物研制,由于严重的致畸性而导致人类、非人类灵长类动物和兔子等多种动物躯体缺陷,如眼睛结构异常。妊娠9 ~ 10 d口服500 mg/kg沙利度胺可诱导出听觉超敏反应、学习能力受损等行为,未发现其他典型的ASD样行为表型[48]。雄性中研究的Snap25表达在VPA和THAL治疗的大鼠的海马和小脑中均升高,致畸物可能通过改变调节大脑正常发育的基因的表达模式来扰乱大脑的个体发育[49]。在孤独症个体中观察到的感觉和知觉异常中,据报道听觉超敏反应很常见。沙利度胺ASD动物模型中听觉脑干的异常揭示了人类孤独症的声音定位和听觉过敏的潜在机制。

5 结语

动物模型在阐明如何导致ASD病理生理学的不同机制方面发挥了重要作用。基于流行病学调查,ASD动物模型大致为药物暴露、母体免疫激活两类。其中MIA模型和产前VPA暴露模型都一致地概括了孤独症的一般症状和表型。博尔纳病毒、特布他林、米索前列醇、沙利度胺等仅作为环境中异常病原生物的代表模型,为孤独症的一些关键特征的神经病理学和相应的行为异常提供了重要线索。

近年来,日益复杂的临床模型在神经化学、神经生理学和神经影像学的研究下使我们对ASD的潜在病因、生物学及神经网络机制有了深入的认识,并对开发治疗新方案和预防策略提供强大支撑。啮齿动物VPA模型可能适合检验ASD的未来干预措施。肠道微生物群与MIA模型中行为之间的密切关联,对于深入揭示了特定微生物分类群(主要在PN 28 d)中的MIA变化,以描述ASD中肠道微生物群谱的明确趋势也至关重要。

目前的药物暴露研究可以为ASD的治疗提供有益的治疗策略参考。实验研究中,非诺贝特[50]、阿戈美拉汀[51]、米诺环素[52]均可显著减弱VPA前期诱导的小鼠社会互动减少等孤独症谱系障碍样行为。此外,非诺贝特还降低了产前VPA诱导的大脑区域氧化应激和炎症,阿戈美拉汀已被证明对VPA暴露前动物的行为、神经化学和血脑屏障改变具有改善作用。米诺环素还减弱脑氧化、亚硝化应激、炎症,增加钙含量和血脑屏障通透性。先前研究分析苏拉明(非选择性嘌呤能拮抗剂)对该模型的免疫学机理[53],另外应用在姜黄素补充改善模型鼠低体重、低脑体积及成熟延迟等方面研究[54]。在该模型鼠的支持下有学者采用不同剂量的右美沙芬分析改善氧化应激和炎症指标的水平,还包括神经元的损伤评分,以及孤独症模型鼠的前额叶皮层和海马中pERK1/2和NMDA信号的表达[55]。Guggulsterone(GST)是一种法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)拮抗剂,通过改变JAK-STAT/PPAR γ信号通路异常表达,从而缓解PPA诱导的成年大鼠孤独症实验模型的神经化学、形态学、大脑病理和组织学变化,孤独症行为得到改善[56]。研究证实促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)治疗对LPS诱导的孤独症大鼠模型中的ASD样症状、学习和记忆过程,神经元损失和神经炎症具有有益作用,通过抑制炎症和神经营养途径发挥作用时存在一些性别特异性[57]。应用艾塞那肽疗法在LPS诱导的孤独症模型中显示出对行为障碍的积极影响,可能是通过抑制炎症和氧化应激以及减少海马胶质病变来发挥其作用。此外,艾塞那肽(Ecenpeptide)也被证明对大脑5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)能和GABA能作用有积极影响[58]。

尽管存在用于诊断ASD的各种脑部成像和神经行为评估工具,但其诊断基础依赖于临床行为。实验动物模型对于了解包括ASD在内的一部分人类疾病的病因和发病机制都很重要。目前的研究将动物模型分为遗传和非遗传模型,其中非遗传模型未来还需在药物诱导ASD模型过程中制定剂量、给药途径、注射次数和妊娠时间等一系列范式共识。希望下一步研究在母体免疫模型中不仅对母体免疫反应进行全面评估,还要提高可重复性工作,并提供对产前免疫激发影响胎儿发育的机制的深入见解,以探索针对免疫系统的新兴临床和临床前治疗,作为ASD药物发现工作的有前途的研究领域。