甘蓝型油菜光敏色素（PHY）家族基因的鉴定及表达分析

李雯谦，解盼，刘蔚，康郁，廖莉，任睿，钱论文,2,3，官春云,2,3，何昕,2,3*

（1.湖南农业大学南方粮油协同创新中心，湖南 长沙，410128；2.湖南农业大学油料作物研究所，湖南 长沙，410128；3.国家油料作物改良中心湖南分中心，湖南 长沙，410128）

作为重要的环境因子之一，光不仅是植物光合作用能量的来源，还是调节植物光形态建成等生理过程的信号来源。在长期的进化过程中，植物进化出多种感受光信号的受体[1]，从而能够感受各种光信号的变化并及时作出响应。目前已知的光受体主要包括光敏色素、隐花色素、向光蛋白、UV-B 受体以及ZTL（zeitlupes）家族蛋白[2]。

光敏色素在植物体内感受红光和远红光[3]，是一种能够形成同、异源二聚体的水溶性蛋白，通常由120～130 kDa左右的脱辅基蛋白和四吡咯环生色团组成[4]。每个单体由氨基端（N-端）结构域和羧基端（C-端）结构域两个结构组成并且通过一个铰链区链接[5,6]。位于氨基端的脱辅基蛋白不具有接收光子的作用，光敏色素蛋白靠生色团吸收光子。四吡咯分子（phytochromobillin，PΦB）在细胞质中和脱辅基蛋白中的半胱氨酸残基形成硫醚键，让整个光敏色素蛋白有接收光子生物功能，所以感光区域位于氨基端。羧基端结构域主要是光调节区，是促进光敏色素二聚体的形成以及色素蛋白的核定位必不可少的。在拟南芥中已经确定并克隆出的光敏色素蛋白有5个，分别为光敏色素A、B、C、D和E（PHYA-E）[7]，根据其在光下的稳定性，分为光不稳定型PHYA 和光稳定型的PHYB-E。在植物细胞中，光敏色素有两种不同的形式，两者在红光和远红光的照射下可以互相逆转。在黑暗中，光敏色素主要以不具生理活性的Pr形式（红光吸收型）位于细胞质中，经过红光照射后，非生物活性的光敏色素会转变为具有生物活性的Pfr形式（远红光吸收型），被激活的光敏色素便会由细胞质转移到细胞核内，对于Pfr 形式的PHYA 来说需要借助穿梭蛋白FHY1/FHL 进入细胞核[8,9]，而其它的光敏色素成员，只需依靠光敏色素蛋白羧基端的核定位序列，即可进入细胞核[10]，进入核内的光敏色素直接与光敏色素互作因子（PIF）结合，调节PIF 对下游相关基因表达的调控作用，从而影响植物光形态建成和其它生理过程。有生物活性的Pfr 在远红光照射或者是黑暗条件下会被蛋白酶降解，转变为不具有生理活性的Pr。

目前对拟南芥的光敏色素研究主要集中在PHYA 和PHYB 的功能，对于PHYC/D/E 研究较少。研究表明，PHYA 在特定条件下能够在红光和远红光的照射下促进种子萌发，PHYB 则主要在红光的调控下促进种子萌发，而PHYE 要在持续的远红光照射下才能促进种子萌发[11,12]。除光照波长外，温度也会影响种子萌发。PHYB 在高于22℃的温度条件下显著促进种子萌发，PHYE 是在低于16℃的温度环境下对种子萌发有功能优势[13]。无光条件下PHYA 在植物体内大量积累，导致幼苗黄化，出现下胚轴伸长、子叶呈弯钩状、前质体发育为黄化体的暗形态建成的情况[14]，并且研究发现phyA突变体在红、白光下和野生型表现一致，在远红光照射下呈暗形态建成，说明PHYA 主要感受远红光。phyB突变体表现出和暗形态建成一样的情况，可见幼苗的光形态建成主要由PHYB 在红光光照下介导发生，PHYC-E 以辅助形式参与其中，完成幼苗去黄化的过程，与暗形态建成表型完全相反[15]；为了避免周围植被遮挡光照，植物会发生主要由PHYB 介导、PHYD 和PHYE 辅助的避荫反应，表现为茎秆和叶柄伸长，株高增加，可以获取更多的光照，抗病虫害能力受影响，严重时还会影响植物的生长发育和产量[16～19]。在低的红光∶远红光（R∶FR）比例下，Pfr 的PHYB 的数量降低，和PIF 结合的能力下降，稳定的PIF能够诱导YUCCA基因表达量增加从而提高生长素的含量并促进植物伸长反应，PHYA 则是在强避荫条件下被激活，抑制下胚轴的伸长，从而抑制避荫反应的过度发生[20]；拟南芥的开花同样受光照和温度的影响，超表达PHYA基因无论在长、短日照条件下都能促进开花[21]。在避荫条件下，由于处于低R∶FR 比例的弱光逆境状态，为了存活，植物常常提前开花，但也会因此导致种子质量下降；如果提高R∶FR 的比例，PHYB、D、E能共同调节花期，则可抑制开花。实验证明当环境温度为22℃时，phyB突变体的花期提前，当温度降低到16℃时，phyB突变体早花现象消失，似乎是PHYE 在低温下发挥主导作用，和种子萌发有相似的结论；在耐寒方面光敏色素也发挥重要作用，在低温条件下，光敏色素能够调控CBF转录因子[22]，促进其下游COR基因的表达，进而提高植物的抗冻性，提高植物在低温下的存活率。

在禾本科植物中，光敏色素只有PHYA、PHYB、PHYC 三种。研究表明，水稻（Oryza sativa）中的PHYA基因在极低辐照度反应（very low fluence response，VLFR）下促进种子萌发，但是高辐照度反应（high-irradiance reaction，HIR）和VLFR 条件下，胚芽鞘的伸长则被抑制[23]。过表达烟草（Nicotiana tabacum）PHYA基因会导致花期提前，叶面积增大；在菊花（Chrysanthemum morifolium）中过表达PHYA基因也会导致花期提前并且影响花色[24]；Zheng 等[25]发现PHYB1 基因主要影响菊花花芽发育。高粱（Sorghum bicolor）、大麦（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、水稻等开花早的作物的早开花期是由于PHYB基因功能缺失突变引起的[26～29]。促进玉米幼苗的去黄化反应和抑制避荫反应则由PHYC基因调控[30]。

油菜是我国种植面积最大的油料作物，对我国的植物油和饲用蛋白的供给安全有重要意义[31]。由于种植模式的改变及湖南省的气候特点，油菜生产过程中面临很多问题，导致油菜产量不高。湖南省光、温资源丰富，油菜合理密植在一定程度上可以提高产量[32]。但是种植密度过大难以避免出现避荫反应。因此，增加油菜光能利用率，提高油菜单位面积产量，培育耐密植的油菜品种也迫在眉睫。

光敏色素在植物避荫反应中起重要的调控作用，也对病菌、虫害、干旱、盐胁迫等抗逆性有一定的影响[33]。因此，我们对油菜光受体中的光敏色素PHY基因家族进行分析，探究其在甘蓝型油菜中生长发育的生物学功能。根据拟南芥的5个PHY基因对比，从甘蓝型油菜、甘蓝、白菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥中分别鉴定其PHY成员，发现它们可分为4 个亚组：PHYA、PHYB、PHYC、PHYE，目前尚未找到AtPHYD直系同源基因。此外还对PHY基因结构、染色体定位和保守结构域进行了分析，预测其功能。另外分析了其组织表达特异性，非生物胁迫和激素处理对PHY基因表达的影响、生物胁迫如核盘菌接种的影响等，以期为甘蓝型油菜PHY基因功能鉴定及其在抗逆、抗病虫害等方面的利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 甘蓝、白菜及甘蓝型油菜PHY 基因家族成员的鉴定与序列分析

从Ensembl Plants 和Brassica Genomics Database中获取拟南芥、甘蓝（CC,2n=2x=18）、白菜（AA,2n=2x=20）、甘蓝型油菜（AACC, 2n=4x=38）、黑芥（BB,2n=2x=16）、芥菜型油菜（AABB, 2n=4x=36）以及埃塞俄比亚芥（BBCC, 2n=4x=34）的PHY基因有关信息，如全长DNA 序列、氨基酸序列等（http://plants.ensembl. org/index. html、http://brassicadb. bio2db.com）。先从网站中下载AtPHY基因的核酸和氨基酸的序列，阈值设置E＜10-5对甘蓝、白菜、甘蓝型油菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥基因组进行BLASTP比对，鉴定PHY的同源基因。

1.2 生物信息学分析

对7 个物种PHY 蛋白序列比对分析（https://www. genome. jp/tools-bin/clustalw），比对图片用网站输出（http://espript. ibcp. fr/ESPript/cgi-bin/ESPript. cgi）。系统发育树用MEGA-X 中的neighbourjoining（NJ）系统发育方法构建，使用poisson 模式，bootstrap 参数设置为2000，其余参数设置为默认。保守结构域用MEME 分析（http://MEME. nbcr. net/MEME/cgi-bin/MEME. cgi）。蛋白的预测分子量（molecular weight，MW）和等电点（isoelectric point，pI）从网站获取（http://web. expasy. org/ComputepI/）。ProtComp 9.0 在线分析亚细胞定位（http://linux1. softberry. com/）。对BnaPHY基因上游2000 bp 的DNA 序列通过Plant CARE 进行启动子区域的顺式元件分析（http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）。基因结构、共线性分析、启动子区域顺式元件分析以及甘蓝、白菜和甘蓝型油菜的PHY基因非同义替换和同义替换间的比例（Ka/Ks）分析通过TBtools软件[34]展示。

1.3 表达分析

主要对BnaPHY基因在不同组织、激素、逆境、接种核盘菌[35]后及春化处理下的表达进行分析。根据HE 等[36,37]以及本课题组尚未公开的数据，分析BnaPHY基因在不同组织的表达量；在上午8：00-下午8：00 期间，对已生长6 周的油菜叶片进行不同激素（100 μmol/L 脱落酸、100 μmol/L 茉莉酸甲酯、10 μg/mL 乙烯和1mmol/L 水杨酸）和高温（40℃）、低温（4℃）处理，油菜根部进行不同逆境（200 mmol/L 氯化钠的盐胁迫和20%聚乙二醇6000的干旱胁迫）处理，分析各BnaPHY基因在3、6 和12h 处理下的表达量以及对开花期接种核盘菌24h 后的表达分析，利用TBtools 生成表达热图。在油菜发育表达资源网站（ORDER；http://order.jic.ac.uk）获取甘蓝型油菜BnaPHY基因经6 周低温春化处理下的表达量分析图[38]。

2 结果与分析

2.1 甘蓝、白菜和甘蓝型油菜等PHY基因鉴定

通过5 个AtPHY 蛋白序列，结合PHY基因保守结构域分析，对甘蓝、白菜、甘蓝型油菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥的参考基因组注释蛋白（http://plants. ensembl. org/index. html、http://brassicadb.bio2db.com）进行BLASTP 搜索（阈值为E-value＜10-5），最终分别鉴定出6 个BoPHY（甘蓝）、5 个BraPHY（白菜）、11 个BnaPHY（甘蓝型油菜）、5 个BniPHY（黑芥）、10 个BjuPHY（芥菜型油菜）和9 个BcaPHY（埃塞俄比亚芥）的PHY基因。

理化性质预测分析发现，基因编码区长度为1653 ～3633 bp；氨基酸数目550 ～1210；分子量61.45 ～134.11 kDa；等电点（pI）预测范围5.03～6.75；亚细胞定位的预测发现51个PHY蛋白均定位在细胞质。与其它成员有显著差异的，是1个PHYC成 员（BcaC08g44236） 和 3 个 PHYA 成 员（Bra020013、BjuA021662和BnaA06g05470D），前者基因编码区长度和氨基酸数目较短，可能是在进化中缺失了部分片段，后者基因编码区和氨基酸残基偏长，其中BnaA06g05470D基因含有8 个内含子，Bra020013和BjuA021662基因含有7 个内含子，推测可能是在复制过程中基因发生了突变。具体信息详见附表1（首页OSID二维码）。

2.2 光敏色素蛋白PHY的序列比对分析

用网站对筛选出的51 个PHY 家族蛋白进行序列比对（https://www. genome. jp/tools-bin/clustalw），结果表明蛋白序列较保守，除BcaC08g44236基因以外，都具有PHY 蛋白的保守结构域：即氨基端的PAS、GAF 及PHY 结构域，羧基端的2 个PAS 结构域和HKRD 组氨酸激酶相关结构域。BcaC08g44236基因只有部分PHY 结构域、羧基端的2 个PAS 结构域以及部分HKRD 组氨酸激酶相关结构域（附图1，见首页OSIC码）。

PHY 蛋白中PAS 和GAF 结构域共同组成含有胆素裂合酶活性的光感受结构域，主要在PAS 或者GAF 发色团和半胱氨酸残基的连接过程中产生作用。PHY 结构域的作用是调节光敏色素的活性，以及稳定具有生物活性形式的Pfr。对于PHYB 来说，羧基端的2 个连续的PAS 结构域，是使其在光照条件下从细胞质定位到细胞核的必要结构，而PHYA则需要借助穿梭蛋白FHY1/FHL 进入细胞核；羧基端的另一个功能则是促进光敏色素蛋白二聚体的形成[39]。

2.3 PHY基因系统进化分析

用51 个PHY 蛋白序列通过MEGA X 构建系统进化树，了解甘蓝型油菜PHY与拟南芥、甘蓝、白菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥的PHY基因之间的进化关系。根据系统进化树，可将PHY 蛋白分为5 个亚组（PHYA、PHYB、PHYC、PHYD 和PHYE）（图1）。

根据甘蓝、白菜、黑芥、芥菜型油菜、埃塞俄比亚芥以及甘蓝型油菜An-和Cn-亚基因组之间的46个Bo/Br/Bni/Bju/Bca/BnaPHY基因的同源关系，共鉴定出5 组Bo-Br-Bni-BjuA-BjuB-BcaA-BcaC-An-Cn 同源基因对，分属于PHYA、PHYB、PHYC、PHYE亚组，其中2 组属于PHYA 亚组，而PHYD 未找到的同源基因。PHYA 亚组中埃塞俄比亚芥只存在1 个位于C 染色体的BcaPHYA1-C（BcaC07g41872）基因，其它物种都有两组完整的同源基因对。在3 个含有C 基因组的物种中都多出了1 个PHYB 拷贝。埃塞俄比亚芥中存有2 个PHYC 成员，其中BcaPHYC-C2（BcaC08g44236）基因编码的蛋白长度明显短于典型完整PHYC 蛋白，极有可能是其附近的BcaPHYC-C1（BcaC08g44314）基因的不完整复制拷贝（图1、首页OSID二维码中的附表1）。

图1 拟南芥（5个）、甘蓝（6个）、白菜（5个）、甘蓝型油菜（11个）、黑芥（5个）、芥菜型油菜（10个）和埃塞俄比亚芥（9个）PHY蛋白的系统进化树分析Fig.1 A neighbor-joining phylogenetic tree of PHY proteins in Arabidopsis,B.oleracea,B.rapa,B.napus,B.nigra,B.juncea and B.carinata

2.4 PHY基因共线性分析

利用TBtools 分析上述物种基因组中所有PHY基因的共线性关系。结果显示11个BnaPHY基因在甘蓝型油菜An-和Cn-亚基因组中的分布分别与（5个）白菜和（6 个）甘蓝的同源基因是对应的，且染色体位置分布相似；10 个BjuPHY基因在芥菜型油菜BjuA-和BjuB-亚基因组中的分布则分别与（5个）白菜和（5 个）黑芥的同源基因相对应，染色体分布相似；9 个BcaPHY基因在埃塞俄比亚芥BcaB-和BcaC-亚基因组中的分布分别与（5个）黑芥和（6个）甘蓝部分对应，它在进化过程中丢失BcaB-亚基因组的PHYA1、PHYA2 成员以及BcaC-亚基因组的PHYA1成员（图2）。

图2 拟南芥、甘蓝、白菜、甘蓝型油菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥共线性分析Fig.2 Syntenic analysis of Arabidopsis,B.oleracea,B.rapa,B.napus,B.nigra,B.juncea and B.carinata

2.5 PHY基因结构分析和MEME分析

进化分析结果显示，大多数PHY基因具有相对保守的基因结构，即在基因的中后段含有2～3 个内含 子 ；而BoPHYA2（Bo5g009990）、BrPHYA2（Bra020013）、BjuPHYA2-A（BjuA021662）、Bn-PHYA2-A（BnaA06g05470D） 以 及BnPHYA2-C（BnaCnng19880D）和其它基因结构有明显不同，除了在基因中后段有2～3 个内含子，基因前端还额外多出2～4 个内含子，暗示这些成员可能是PHYA1 成员的复制（图3A）。

MEME 分析发现几乎所有PHY 成员都包含15个相对保守的motif。其中motif9、2、7 组成PHY 蛋白的氨基端，分别是PAS、GAF、PHY 结构域，motif6、1、13、15 组成PHY 蛋白的羧基端，分别是PAS Ⅰ、PAS Ⅱ、His Kinase A、His Kinase-like ATPase 结构域，这两部分由一个铰链区连接（图3B）。以上结果表明：在芸薹属中，尽管部分PHY 成员基因结构发生了变化，但蛋白序列高度保守，暗示PHY 在植物的生长发育有着至关重要的作用。

图3 拟南芥、甘蓝、白菜、甘蓝型油菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥PHY的基因结构分析（A）和MEME分析（B）Fig.3 Gene structures（A）and MEME motifs analysis（B）of Arabidopsis,B.oleracea,B.rapa,B.napus,B.nigra,B.juncea and B.carinata PHY genes

2.6 PHY基因的Ka/Ks分析

为了更好的知道PHY家族基因在拟南芥、甘蓝、白菜和甘蓝型油菜间的进化关系，对27 个PHY基因进行了Ka/Ks分析（数据见首页OSID 二维码的附表2）。结果显示所有的PHY基因都受到了纯化选择（Ka/Ks＜1）。

2.7 甘蓝型油菜BnaPHY 基因启动子区域顺式元件分析

PHY基因启动子（上游2000 bp）序列中的各类顺式元件用Plant CARE（http://bioinformatics. psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）分析，结果可分为植物激素响应顺式元件6 种（Auxin、GA、SA、ABA、MeJA 和ET）、环境胁迫响应顺式元件6 种（Low-T、Stress、Anaerobic、Wound、Light、Circadian）和转录因子结合位点3 种（MYB、MYC 和W box）以及一些基因特有的响应顺式元件。

如（首页OSID 二维码的）附表3 和图5 所示，甘蓝型油菜的BnaPHY基因中有144 个顺式元件与植物激素响应有关，211 个顺式元件与环境胁迫响应有关，145 个顺式元件与转录因子结合位点有关，4个顺式元件和新陈代谢有关，4 个唯一功能的顺式元件，还有32 个功能不清楚的顺式元件，分析一共得到540 个顺式元件。其中的ABA 响应顺式元件，在植物激素类响应中最多；光响应顺式元件，在环境胁迫响应中最多；而转录因子结合位点最多的是MYC结合位点。

2.8 甘蓝型油菜BnaPHY 基因在不同组织中的表达模式分析

根据甘蓝型油菜BnaPHY基因在不同组织（根、茎、叶、芽、萼片、雄蕊、幼嫩雌蕊、开花期雌蕊、衰老期雌蕊、胚珠、角果皮和角果）中的RNA-Seq 数据进行分析，结果显示BnaPHY 不同成员存在明显不同的组织表达模式（图5）。

图4 BnaPHY基因启动子区域顺式元件分析Fig.4 Analysis of cis elements in promoter region of BnaPHY gene

图5 BnaPHY基因在不同组织器官中的表达热图Fig.5 Expression heat map of BnaPHY genes in different tissues and organs

PHYA 亚组的BnaCnng19980D和BnaA06g0547 0D基因在植物各部位都有表达，BnaC08g42660D和BnaA09g48410D基因除了根和萼片中有较高表达，其它部位表达偏低；PHYB 亚组基因中BnaC05g36390D和BnaA05g22950D基因除了在幼嫩雌蕊中表达量低，在其它组织有较高的表达量，BnaC03g39830D基因在幼嫩雌蕊、开花期雌蕊、衰老期雌蕊几乎不表达；PHYC 亚组基因在各组织中有轻微的表达，而PHYE 则是开花期雌蕊中的表达量高于其它组织。

2.9 甘蓝型油菜BnaPHY 基因的不同非生物逆境和不同激素处理表达模式分析

通过对叶片和根部进行不同的处理，分析Bna-PHY在不同非生物逆境以及不同激素处理下的表达模式。叶片分别进行低温（Cold）、高温（Hot）、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（ET）和水杨酸（SA）处理，根分别进行盐胁迫（NaCl）和干旱胁迫（PEG）处理，测定处理后每个基因的TPM 值。如图6所示，PHYA亚组在叶片中的表达受低温和高温的调控，特别是BnaCnng19880D基因在高温条件下表达量明显增强，对根部进行盐胁迫和干旱胁迫处理没有明显变化；同样在叶片中PHYB 基因表达受低温和高温诱导，经过盐胁迫处理后BnaA05g22950有轻微上调；在高温处理下PHYC 亚组基因表达量有轻微变化；PHYE 亚组基因叶片在经过低温处理后表达量有改变，BnaA01g08940D基因在Cold_3h 中叶片表达量达到最高，BnaC01g40810D基因在Cold_6h中叶片有最高的表达量。整体来看，PHY基因家族的表达主要受温度调控，并且在不同温度条件下有响应的基因不同，而其它非生物胁迫和激素处理对PHY基因表达的影响不明显。

图6 BnaPHY基因在不同非生物胁迫和植物激素处理下的表达Fig.6 Expression heat map of the BnaPHY genes under different abiotic stresses and plant hormone treatments

2.10 核盘菌接种后甘蓝型油菜BnaPHY 基因表达模式分析

核盘菌是一种寄主范围广，能引起多种病害发生的植物病原菌，会对作物造成巨大的经济损失[40]。越来越多的研究证实，PHY基因在植物抗病中起着重要的调控作用[41～43]。通过对BnaPHY基因在接种核盘菌后的甘蓝型油菜叶片中的表达模式分析发现，PHYA 中的BnaC08g42660D和BnaCnng19880D基因的表达明显受核盘菌接菌处理的诱导，且在感病材料（Westar）中的表达量高于在抗病材料（ZY821）中的表达量；其它成员的表达则明显受核盘菌接菌处理的抑制，但同样在感病材料中的表达量高于在抗病材料中的表达量（图7）。

图7 抗感油菜品种接种核盘菌后BnaPHY基因的表达分析Fig.7 Expression of BnaPHY gene after infection with Sclerotinia sclerotiorum

2.11 甘蓝型油菜BnaPHY 基因在春化处理中表达模式分析

为了分析BnaPHY在春化处理下的表达模式，我们利用油菜发育表达资源网站（ORDER；http://order.jic.ac.uk）对甘蓝型油菜BnaPHY基因在春化处理（播种后22～64 d）和不同发育阶段（苗期：春油菜0～72 d，冬油菜0～83 d；蕾薹期：春油菜72 d以后，冬油菜83 d 以后）中的表达量进行了检测，得到春油菜（Westar）和冬油菜（Tapidor）在春化和不同发育阶段茎尖和叶片中BnaPHY的表达值。如图8 所示，春、冬油菜茎尖和叶品中PYHB 亚组成员的表达量在春化处理过程中均明显地下降，春化处理结束后则急剧上升然后回落；PHYC 和PHYE 亚组成员则相反，其表达量在春化处理过程中显著上升，春化处理结束后则有小幅回落，然后大幅升高再逐渐回落。春化处理过程中，PHYA 中的BnaCnng19880D和BnaA06g05470D的表达量在春、冬油菜茎尖和叶片中均明显地上升，而BnaC08g42660D的表达量在叶片中明显地下降，在茎尖中无明显变化；春化处理结束后，BnaA06g05470D和BnaC08g42660D的表达量在春、冬油菜茎尖中有小幅度的上下波动，但在叶片中则快速上升，然后回落；而BnaCnng19880 D的表达量在冬油菜茎尖中则明显回落，然后急剧升高，在春油菜的茎尖中却无回落，蕾薹期急剧升高然后回落。春化处理结束后，BnaCnng19880D的表达量在春、冬油菜的叶片中变化趋势大体一致，均是先小幅度上升，然后回落。

图8 春油菜（Westar）、冬油菜（Tapidor）春化过程中BnaPHY基因的表达Fig.8 Expression profiles of BnaPHY genes during vernalization in the spring-type（Westar）and winter-type（Tapidor）rapeseed cultivar

3 讨论与结论

PHY 蛋白参与植物感温。PHYB 不仅作为光受体感受光信号，还作为传感器感知外界温度的变化[44,45]。高温下PHYB 促进PIF4 蛋白的积累，从而调控与热响应有关基因的表达[46]；低温下PHYB 间接参与CBF 转录因子的调控，提高植物的抗冻能力[47]。转录组分析发现甘蓝型油菜在短期内的高、低温处理下PHYA 和PHYB均被诱导表达；PHYC和PHYE 则主要受低温诱导。而春化处理期间PHYB的表达量明显被抑制，其它亚组的表达量则基本呈现上调趋势，说明甘蓝型油菜PHY基因在高、低温环境以及不同时间长短的低温环境下的应答调控功能存在一定的分化，具体基因的功能可以根据需要，改变基因的表达，进行验证。

在生物胁迫中，PHY 蛋白可以直接调控抗病、抗虫的基因表达。PHY基因通过影响水稻体内（水杨酸和茉莉酸两种激素抗病途径）有关基因的表达量，来调控对稻瘟菌的抗性。此外光敏色素还可通过调控茉莉酸的信号途径和合成代谢，来调节植物对虫害的抗性[33]。通过转录组分析发现，大多数甘蓝型油菜PHY基因的表达均受核盘菌的显著抑制，两个PHYA 成员BnaC08g42660D和BnaCnng19880 D的表达则受核盘菌的显著诱导。不同于以往报道，甘蓝型油菜PHY基因对茉莉酸和水杨酸无明显响应，说明甘蓝型油菜PHY可能是通过其它信号路径来响应和调控核盘菌抗性的，具体调控方式还有待研究。

其它植物中对PHY基因的研究报道已有很多，比如在拟南芥和水稻中就分别发现了5 个AtPHY基因和3 个OsPHY基因，玉米有6 个，小麦（Triticum aestivum）有9 个[48]，马铃薯有5 个[49]。本研究在甘蓝型油菜、甘蓝、白菜、黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥中分别鉴定了11 个、6 个、5 个、5 个、10 个和9个PHY家族基因。生物信息学分析表明，PHY基因结构在芸薹属植物进化过程中具有较高的保守性。在基因表达谱分析中甘蓝型油菜PHYA 的BnaCnng19880D和BnaA06g05470D基因受高温和低温调控，BnaCnng19880D接种后又受核盘菌的显著诱导，说明甘蓝型油菜PHY基因在功能上存在一定的功能冗余，同时也发生了功能分化。本研究为进一步了解甘蓝型油菜PHY家族基因在响应光、逆境胁迫的生物学功能提供了参考。