蓖麻种质资源遗传多样性与群体结构的SSR分析

王姣梅，汪磊，谭美莲，汪魏，王玲，严兴初，王力军

（中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北 武汉，430062）

蓖麻（Ricinus communisL.）为大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻属双子叶一年生或多年生草本植物[1,2]，原产于非洲，后传入亚洲、欧洲、美洲等，具有“绿色能源”油料作物之称[3]。目前，不少蓖麻品种存在产量低、杂种分离现象严重，杂交育种面临着亲本来源基础狭窄的问题。因此，加强蓖麻种质资源的收集保存和鉴定评价十分重要，不仅是对蓖麻品种资源的保护，更是蓖麻育种材料的基础积累。目前，全球有10个国家建立了蓖麻种质资源库，共收集和保存了蓖麻种质资源17 995 份[4]，其中我国保存的蓖麻资源有3332份。

搜集种质资源，并开展资源的鉴定评价是品种选育的基础。我国保存有丰富的蓖麻资源，开展种质或品种间遗传多样性和群体遗传结构的分析可为蓖麻育种杂交组配、群体构建亲本选择提供参考。目前，国外已有较多基于不同分子标记技术开展蓖麻种质遗传多样性评价的研究报道[5～9]，群体遗传结构分析也有少数涉及[10,11]。He 等[12]利用MSAP（甲基化敏感扩增多态性）标记对60 份蓖麻地方种质进行表观遗传多样性分析，结果表现为中度变异，种群间变异范围为3.80%～34.31%；Foster 等[13]利用48 个SNP 位点对来自45 个国家的676 份蓖麻种质进行了遗传多样性分析，显示出较低的遗传变异水平，且分布与地理位置的相关性不大；Kallamadi 等[14]基于RAPD、ISSR 和SCoT 标记对31 份种质进行遗传多样性分析，结果显示为中度水平的遗传变异。此外，还有利用RAPD 和AFLP 等显性标记[15,16]和SSR、EST-SSR 共显性标记[17,18]进行不同蓖麻种质材料的遗传多样性分析，均表明其遗传变异相对较低。近年来，Sentilvel 等[10]利用45 个SSR 标记对144份核心蓖麻种质近等系（从3000多份蓖麻种质中选出）进行了遗传变异和群体结构的分析，结果显示中度多样性，77%的种质间无系谱关系，基因型之间遗传亲缘程度很低，群体结构缺失；Wang 等人[11]利用22对EST-SSR引物对基于含油量、脂肪酸组分和国家来源挑选出来的574份蓖麻种质开展遗传多样性和群体结构分析，结果显示为中等水平的遗传多样性（异化系数为0.53），分为4个亚类，这些类群和亚群与地理位置一致。

国内在蓖麻遗传多样性方面的研究也有报道，但主要是集中对某一地区的材料进行遗传多样性和亲缘关系的评价。如崔宏亮等[19]基于主要农艺性状对104 份新疆蓖麻种质资源进行变异和聚类分析；杨婷等[20]和汪亚菲等[21]分别基于表型性状和SSR标记对302 份和240 份华南野生蓖麻种质进行了分类评价和遗传多样性分析。但对来源于我国不同产区和国外的蓖麻种质缺乏系统的多样性评价和群体结构分析。

前人这些相关研究对我国蓖麻种质资源的评价、利用和育种都起到了一定参考作用。通过多年的收集，我们保存有来自全国20多个省市的蓖麻种质和少量国外种质3300 多份。为更好地加强蓖麻种质资源的提供利用，促进我国蓖麻遗传改良和杂交育种进程，满足蓖麻育种对亲本选择的需求，拓宽蓖麻育种亲本的遗传基础，本研究基于种质来源和前期农艺性状观察，利用早期开发的86对基因组SSR 引物，对来源于国内5 个地区（16 个省市）和国外3 个国家的共191 份蓖麻种质进行遗传多样性和群体遗传结构分析，为蓖麻种质资源的有效收集、高效保存及育种亲本选择与利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

由国家油料作物种质资源中期库（依托中国农业科学院油料作物研究所）提供的191 份蓖麻种质资源（附表1，详见首页OSID 码），这些资源分别来源于国内5 个地区（16 个省市）和其它3 个国家（按地理来源不同分为5个国内区域和1个国外种群）。

1.2 DNA 提取

采集蓖麻种质的嫩叶，利用CTAB 法[22]进行DNA 提取，用TE 溶解至100 μL，并在微量核酸蛋白分析仪（Nanodrop 2000）上测定DNA 浓度及纯度，将原液保存于-20℃备用。

1.3 引物合成及多态性筛选

随机抽取10 份DNA 材料（编号2、64、96、114、120、134、160、168、184 和190），根据已公开发表的文献资料[23]，选取多态性较好的96 对SSR 引物（由上海生物工程有限公司合成）进行筛选。SSR 扩增体系和反应程序具体如下：PCR 反应体系为20 μL，包括20 ng DNA 模板，0.2 μmol/L 正、反引物，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs；1×Buffer，1 U/μL TaqDNA 聚合酶。扩增反应程序为：95℃3 min；10个循环：94℃30 s，65℃（每循环下降1℃）30 s，72℃45 s；30 个循环：94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s；72℃延伸10 min；4℃保存。将筛选中扩增效果好、多态性稳定的86对SSR 引物（引物序列信息附表2，详见首页OSID码）。

1.4 条带统计及聚类分析

读取条带，根据条带有无建立0、1矩阵，有带为1，无带则为0，统计数据输入Excel 表格，建立各标记扩增谱带矩阵数据。利用PopGene1.32软件分析SSR 引物有效等位基因数（Na）、香农信息指数（I）、观察杂合度（Ho）和期望杂合度（He）等多样性指标。利用NTSYSpc 2.10e 和Structure2.3.4 软件对蓖麻种质分别进行遗传相似系数和群体遗传结构分析[24,25]。使用MEGA7.0 软件进行群体间UPGMA 法聚类树绘制。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及遗传多样性分析

通过引物多态性筛选，从96 对SSR 引物中获得86对带型清晰、多态性好的引物，用于191份蓖麻种质的遗传多样性分析（部分样品扩增结果见图1）。86 对引物在191 份材料中共扩增出194 个等位基因，每对SSR 引物标记的等位基因数为2～4个，平均值为2.26 个。香农信息指数（I）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和Neil’s 多样性指数（H）的变化范围分别是0.04～1.06、0.01～1.00、0.01～0.65 和0.01～0.64，平均值分别为0.54、0.29、0.36 和0.36（表1）。其中，引物GRC504 和GRC536 的等位基因数最高（4）；引物GRC994 有效等位基因数最高（2.79），有效等位基因数最少（1.01）的是GRC798、GRC914 和 GRC953；引物 GRC562、GRC832、GRC837、GRC886 及GRC910 有效等位基因数与等位基因数的比值为1.00，说明该基因位点上的等位基因在群体中的分布最均匀（见附表3，首页OSID码）。

表1 蓖麻种质的遗传多样性分析Table 1 Genetic diversity analysis among castor bean accessions

图1 引物GRC826在部分样品中的扩增情况Fig.1 Amplified profiles for GRC826 primer among some accession

2.2 遗传相似系数分析

基于86 对SSR 标记的带谱，利用NTSYS-pc 2.10e 分析191 份蓖麻材料的遗传关系。结果发现材料间的遗传相似系数介于0.46～0.96，平均为0.71。其中，辽蓖163 与辽蓖168 的遗传相似性最大，而西昌15-4与哲资364和通蓖11号的遗传相似系数最低，为0.46，表明西昌15-4 与哲资364 和通蓖11 号的亲缘关系较远。不同材料之间的遗传相似系数值大多分布在0.60～0.80，占69.27%，相似系数小于0.50 的占0.42%（图2），说明191 份蓖麻种质的遗传多样性中等。

图2 191份蓖麻种质资源的遗传相似系数Fig.2 Genetic similarity coefficient of 191 castor germplasm accessions

2.3 蓖麻种质的聚类分析

利用MEGA7.0 软件进行聚类分析表明：191 份蓖麻种质在遗传距离0.20 处被分成2 个大类群（图3）。Ⅰ组含79 份材料，占供试材料的41.4%，其中来自华北、国外、西南、华中和东北种质群的材料分别为37 份、27 份、9 份、5 份和1 份；Ⅱ组则包含112份材料，其中华北35份、国外1份、西南31份、华中1份、东北38 份和西北6 份。每个类群中均包含不同数量的各地区种质，并未完全按地理来源集中聚为相应的类群，说明它们的遗传亲缘关系与地理来源没有直接关系。在遗传距离为0.15处，可进一步将这两个类群划分为4个亚群（A、B、C、D）。随着遗传相似系数的增加，来自同一种质群的材料有聚到一起的趋势。如C 亚组20 份材料中主要为西北种质，仅含1 份华中种质群。华北种质群的材料在A 和D两个亚群中均有分布，但在亚群A中相对比较集中；东北种质群的材料分布在亚群D 中，国外种质和华中种质主要分布在A 亚群中，西南种质大部分分布在D亚群中。

图3 191份蓖麻种质的UPGMA 聚类图Fig.3 UPGMA dendrogram of 191 castor bean accessions

2.4 蓖麻种质资源的群体结构

利用Structure2.3.4 软件对191 份蓖麻材料进行群体遗传结构分析（图4A），随着K值的增加，LnP（D）一直上升，无明显的拐点，无法确定最佳群体数。因此，用ΔK 来确定K 值的最佳数目，当K=2时，ΔK 取得最大值（图4B）。因此，群体结构分析结果可将191 份蓖麻材料划分为2 个类群（图5）。在群体遗传结构分析中，当遗传组分（Q 值）≥0.6 时，共有170 份蓖麻材料，被划分到对应的2 个类群中，表示材料的遗传背景相对比较单一；而Q 值＜0.6的，只有21 份，说明这21 份蓖麻种质具有混合来源，遗传背景较为复杂，无法明确某一类群，因此划为混合类群（表2，附表4，详见首页OSID 码）。由表2可知，第1类群（图5中红色部分）含有86份种质资源；第2类群（图5中绿色部分）含有84份种质资源。在所有的蓖麻材料中，来源相近的材料划分类群也存在差异，比如来自内蒙古的22 份材料，其中8 个被划分到到混合类群中；来自山西的21个材料多数划分到类群2 中，其中编号19 被划分到混合类群中，表明了来源相近的材料间也存在较大的遗传结构差异。

表2 191份蓖麻在2个类群中的分布Table 2 Distribution of 191 accessions in two groups

图4 K值与LnP（D）和ΔK趋势变化图Fig.4 Distribution of K-values with LnP（D）and ΔK

图5 蓖麻种质的遗传结构分析Fig.5 Genetic structure analysis of castor bean accessions

3 讨论

蓖麻种质资源的收集和保存，是育种家开展品种选育工作的基础，也是育种改良成功的关键。国内学者对蓖麻种质资源的生物学特性，各农艺性状间存在的关系，都进行了很好地分类、归纳和总结[26～28]。由于形态表型性状易受环境等因素的影响，而难以全面真实地评价种质的多样性和亲缘关系。因此，品种选育和种质资源开发利用过程中，将传统方法与生物学相关技术相结合，探索其遗传多样性的丰富程度，掌握其分布规律及特点，对优质蓖麻资源的挖掘利用、育种亲本的合理选配、优良基因的定位及品种鉴评等具有极其重要的指导意义。

本研究利用86对SSR标记对191份蓖麻种质进行遗传多样性分析，结果表明其遗传多样性处于中等水平，与前人的研究结果基本一致[6,29]。前人对来自印度[30]、中国[31]、巴西[32]、美国等[10,11]世界范围收集的蓖麻种质资源进行了遗传多样性研究，这些研究表明蓖麻种质资源之间的遗传多样性中等。在少数利用分子标记进行多样性分析的研究中[15～18]，蓖麻种质间遗传多样性更低。这可能跟其种属分类只有单一的一个种，遗传基础相对较窄有关，也可能是由于使用的标记数较少，或与分子标记的类型和种群有关。因此，在蓖麻的育种工作中，既要扩大蓖麻遗传基础，增加优良亲本的选择，同时也要进一步优化引物设计，开发更多的多态性引物。

聚类分析和群体遗传结构分析是研究种质资源遗传多样性的有效方法。群体遗传结构分析能反映出材料间基因交流和渗入情况，能更好地说明材料间的遗传结构，有助于育种者准确地掌握种质间的遗传关系。基于聚类和群体遗传结构对来源于国内5 个地区（16 个省市）和其它3 个国家的191份蓖麻种质进行分析，结果分为2大类群，不同地区来源的种质相互交错，亲缘关系与地理来源没有明显的相关性。Senthilvel等人[10]基于聚类主坐标分析（PCoA）和群体遗传结构分析都表明，自交系中没有明显的遗传结构。这可能是因为近交系来自核心集合，在核心构成过程中去除了密切相关的基因型；或是蓖麻是异交种，个体之间有广泛的基因流动，使种群分化水平低。因此，在蓖麻的育种中，要利用杂种优势，选择亲缘关系较远的亲本进行杂交，增加后代的遗传变异。

4 结论

本研究通过对来源于国内5个地区（16个省市）和其它3 个国家的191 份蓖麻种质进行遗传多样性评价及群体遗传结构分析和比较，表明其遗传多样性中等。聚类和群体结构分析都将这些蓖麻材料划分为2 个类群，遗传结构分析显示大多数蓖麻种质的遗传背景相对比较单一，只有少数种质（21 份）具有混合来源，遗传背景较为复杂。本研究了解了不同地区和国家来源蓖麻种质的遗传关系，为今后蓖麻育种提供了丰富的材料，这些材料中的一些优异种质经过系选后有望服务于蓖麻品种改良和种质资源创新。