牛胚胎冷冻技术及冷冻保护剂研究进展

翟亚莹 张子敬 吕世杰 朱肖亭 张格阳 朱进华 李峥 于翔 王红利 施巧婷 闫祥洲 王二耀*

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州 450002；3.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450008；4.河南省动物检疫总站，河南郑州 450000；5.河南省郏县红牛产业发展中心，河南平顶山 467100）

胚胎冷冻保存是胚胎移植过程中重要的步骤之一，在地方牛品种遗传资源保护方面具有广泛的应用价值，最早可以追溯到20 世纪50 年代初期，Smith用甘油作为冷冻剂冷冻了600 枚兔的胚胎，解冻培养只有6 枚发育。1972 年，Whittingham[1]首次将小鼠胚胎置于超低温（-196℃）的液氮中，液氮中的细胞代谢速率下降，胚胎能长期稳定保存，复苏后小鼠胚胎仍能够存活，开启了胚胎冷冻技术的先河。胚胎冷冻技术将胚胎稳定地存于液氮中，将体外胚胎进行跨时间、区域运输，克服了地区和时间的限制，使这些胚胎广泛用于胚胎移植行业。近年来，最广泛应用的是快速冷冻法和玻璃化冷冻法，该文将从胚胎冷冻技术发展历程、冷冻保护剂等方面展开综述。

1 胚胎冷冻技术

胚胎冷冻技术就是将动物的早期胚胎置于冷冻保护液中，通过降温措施，将胚胎稳定存放在液氮中，使胚胎的生命活动减弱或暂时中止，但复温后可以迅速恢复生长的能力，以达到长期体外保存胚胎的目的。胚胎的冷冻液可以用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）配制，pH 保持7.2～7.4，也可用TCM-199 或生理盐水来配制[2]。冷冻胚胎过程中温度降至-15～-50℃时，大的冰晶易在细胞内形成，冰晶的形成对于细胞来说是致命的，很可能导致细胞的死亡[3]。随着人们对胚胎冷冻技术的探索，人们不断克服常规冷冻方法存在的缺点，尝试通过改变冷冻方法、添加冷冻保护剂等方式提高胚胎冷冻的效率。胚胎冷冻的方式主要有三种：慢速冷冻法，快速冷冻法，玻璃化冷冻法，目前玻璃化冷冻法广泛应用于生产实践。胚胎冷冻技术对于保护良种牛，发展优秀种质资源有着重大意义。

1.1 慢速冷冻法

乙二醇（EG）、甘油（GLY）、二甲基亚砜（DMSO）等常被作为慢速冷冻法的冷冻保护剂。胚胎被浸泡在浓度由低到高的冷冻保护剂中，分三步或四步使其完全进入胚胎，然后用冷冻装置缓慢冷却，降温速度低于1℃/min，当温度达到-30～-80℃时，将胚胎放置于在液氮中[4]。1973 年慢速冷冻法首次用于冷冻牛胚胎，解冻后经胚胎移植成功生出小牛[5]。

慢速冷冻法的缺陷体现在以下几个方面：第一，胞内水过冷状态不稳定，会形成胞内冰晶，使胚胎的存活率和着床率较低。第二，慢速冷冻需要控制冷冻速率，以减少冰晶形成对胚胎造成的伤害，因此，冷冻过程需要较长的时间。第三，慢速冷冻法会使胚胎过度脱水，必须采用慢速解冻法，缓慢复苏胚胎，提高胚胎成活率。慢速冷冻法对胚胎伤害较大，冷冻过程烦琐，解冻过程复杂，这些因素限制了慢速冷冻技术的广泛应用。

1.2 快速冷冻法

快速冷冻法由慢速冷冻法改进而来，不需要使用梯度冷冻，而是直接将胚胎投入液氮中。快速冷冻法优点是耗时短，冷冻液作用时间短，对胚胎毒性小，缺点是降温速度快，冰晶形成多[6]。

快速冷冻法经常使用两种或两种以上物质作为冷冻保护剂。甘油和蔗糖（sucrose）首次作为胚胎冷冻剂冷冻小鼠胚胎，解冻复苏后囊胚率达到61%～65%[7]。Chupin 将2.8mol/L 甘油和0.25mol/L 蔗糖作保护剂冷冻牛胚胎，将牛胚胎直接投入液氮冷冻，解冻复苏后胚胎囊胚率为50%。科研人员对该方法进一步改进，将牛胚胎置于液氮瓶颈处预冷5min，再将胚胎投入液氮，解冻后胚胎的囊胚率可达67.6%。为了进一步简化胚胎解冻过程，国内研究人员将1 份保护剂和3 份稀释剂直接装入冷冻胚胎的细管中。解冻后，轻敲管子，使溶液在管内混合，冷冻保护剂被高度稀释，可以实现将胚胎直接移植，简化了胚胎解冻的烦琐过程[8,9]。

1.3 玻璃化冷冻

玻璃化冷冻是1985 年兴起的一种胚胎冷冻方法。该方法通过添加高浓度的冷冻剂使胚胎快速脱水，在0℃以下投入液氮中对胚胎进行冷冻保存，操作简单，不需要昂贵的仪器设备。玻璃化法高浓度的冷冻剂在低温下呈现黏稠态，达到临界值时液体发生固化，形成了没有结构的玻璃态，从而避免冰晶的形成，减少冰晶对于细胞的损害[10]。另外，牛胚胎在慢速冷冻法中具有冷敏感性，该方法可以避免这种冷敏感，使得存活率比慢速冷冻法的存活率更高[11]。玻璃化冷冻的缺点主要体现在高浓度冷冻剂的毒性作用，因此需要严格控制冷冻剂的作用时间。虽然玻璃化冷冻还存在缺陷，但科研工作者们在不断探索改进，相信该方法将有很大提升和广阔的应用前景。

1.3.1 两步法

最初Kasai 进行玻璃化冷冻的探索，以25%甘油和25%丙二醇（PG）为冷冻液，将小鼠8 细胞进行玻璃化冷冻，取得了不错的效果。但此配方应用于牛胚胎体外培养时，牛胚胎到桑椹胚便停止发育。随着科技的进步，科研人员改进了冷冻液配方，两步法中的冷冻液由40%乙二醇、18%聚蔗糖（ficoll）以及0.26%蔗糖（sucrose）在TCM-199 中组成。冷冻步骤分两步进行：冻存前，胚胎在0.8mL 的20%乙二醇液中存放3min，继而转移至0..8mL 的玻璃化冷冻液中短暂停留，随后装入0.25mL 冻精细管，在30～45s内投入液氮罐中保存[12]。通过两步法冻存的牛胚胎可以更好地发育，冻存液对于胚胎的各个发育时期均具有保护作用。丁家桐通过该方法冻存山羊胚胎，解冻移植后的妊娠率达到61.5%，产羔率达到40%[13]。朱世恩通过两步法冻存兔囊胚胚胎，解冻后发育率达到90%，妊娠率达到29.2%[14]。

1.3.2 开放式细管法（OPS 法）

OPS 冷冻法是使用OPS 薄壁吸管，加热后将其拉至管的一半直径和厚度，利用毛细管现象将极少量的冷冻液与胚胎一起吸至OPS 管的末端，最后将OPS管直接放入液氮中进行冷冻保存[14]。OPS 法操作便捷，不要冷冻仪器，极少的冷冻液可达到迅速冷冻、快速解冻以及快速去除保护剂的目的。由于管中冷冻液量很少，还减少了对胚胎的毒害作用。此方法近年来已经广泛用于牛胚胎的冷冻保存。

1.3.3 Cryotop 冷冻法

Cryotop 法与OPS 法有类似之处，将含有胚胎的玻璃化液滴（约0.1μL）放置在细聚丙烯条内，然后立即垂直放入液氮中完成冷冻，冷冻后用塑料帽盖住Cryotop 板，存放在液氮中[15]。该方法使用的冷冻液体积更小，冷冻和解冻速率更高。用Cryotop 法冷冻保存牛胚胎可以使囊胚孵化率达到90%，Cryotop 法简单便捷，是一种实用的玻璃化冷冻技术[16]。

2 冷冻保护剂

冷冻保护剂是为了减少或防止细胞在冷冻过程中受到损伤的试剂，目前常分为细胞内液冷冻保护剂、细胞外液冷冻保护剂和抗冻蛋白等。在慢速冷冻法中，只有一种物质被用作冷冻保护剂，如甘油、乙二醇、DMSO，而在快速冷冻法和玻璃化冷冻法中，通常是几种冷冻保护剂同时使用。

2.1 细胞内液冷冻保护剂

细胞内液冷冻保护剂通常是分子量小且具有穿透细胞膜能力的物质，如乙二醇，甲醇（MT），丙二醇、甘油、二甲基亚砜等。Rall 和Fahy 用20.5%DMSO、15.5%乙酰胺、10%丙二醇、6%聚乙二醇作为玻璃化冷冻液，冷冻小鼠胚胎，获得了87.7%的冷冻成活率[17]。许文兵的研究指出，以EG 为冷冻保护剂，固体表面载杆为冷冻载体，冷冻转基因牛的早期囊胚可以获得最佳效果[18]。

2.2 细胞外液冷冻保护剂

细胞外液冷冻保护剂常为大分子、非渗透性细胞膜物质，例如蔗糖、海藻糖（trehalose）、半乳糖（galactose）、聚蔗糖、海藻糖（trehalose）等。蔗糖因其在低温下对细胞没有毒害作用，而被作为玻璃化冷冻保护液的主要成分广泛应用[19]。2004 年，Gong 等采用OPS 法玻璃化，以40%乙二醇+30%聚蔗糖+0.5mol/L 蔗糖为冷冻保护剂，冷冻牛的SCNT 囊胚，第60d 妊娠率和产犊率均为33.3%[20]。Zhao 等用15%乙二醇+15%DMSO+0.3mol/L 蔗糖为冷冻保护剂，使用OPS 冷冻法玻璃化冷冻牛ICSI 胚胎，解冻后存活率为82.4%[21]。近年来的研究表明，乙二醇、蔗糖、聚蔗糖作为冷冻保护剂配置成的EFS40 是比较理想的冷冻保护液。

2.3 抗冻蛋白

抗冻蛋白（AFPs）是一类能附着在冰晶表面，与冰晶结合后可以遏制其生长的蛋白质，由Devriesde等在海冰地区鱼类血液中鉴定出来[22]。后来科研人员不但在多种鱼类中鉴定出该物质，在植物和昆虫体内也有发现。AFPs 具有稳定细胞膜的作用，与冰晶结合后可以阻止冰晶生长，在冷冻液中再结晶，减少细胞损伤。该物质应用于牛胚胎冷冻可以减少冰晶对胚胎的伤害，对保持胚胎完整性具有重要意义。

3 展望

胚胎冷冻技术对我国保护地方肉牛种质资源发挥着重要作用。随着该技术的不断成熟，牛胚胎冷冻效率会进一步提高，特别是玻璃化冷冻法，其操作方便，对胚胎损伤较小，一定会有巨大的应用前景。