饲粮蛋氨酸水平对高密度饲养肉鸡生长性能、抗氧化及抗应激能力的影响

伍 源，秦 鑫，董元洋，韩苗苗，苗志强，魏清宇，宋献艺，申李琰，冯 焱，李慧锋，李建慧

(1.山西农业大学动物科学学院，太谷 030801；2.山西农业大学生命科学学院，太谷 030801)

肉鸡产业集约化养殖使得生产效率提高，但饲养密度的提高会导致肉鸡健康出现各种问题从而影响经济效益[1-3]。有研究表明，当肉鸡饲养密度达到20只/m2时会使家禽产生应激反应，降低肉鸡的采食量和体重[4]，导致体内氧化还原状态失衡，引起机体氧化损伤[5]。蛋氨酸作为合成谷胱甘肽的前体，是禽类的第一限制性氨基酸[6]。蛋氨酸可以通过减少线粒体活性氧产生，调控Nrf2、ATF4、AP-1等转录因子介导的关键信号通路等方式参与氧化应激的调控[7]，改善氧化状态并在一定程度上促进机体健康。在饲粮中适量补充蛋氨酸可以显著改善肉鸡的生产性能[8-9]，提高鸡肉品质，增强肉鸡肝脏、血清抗氧化能力[10]。而蛋氨酸缺乏(饲粮蛋氨酸水平为0.28%时)则会影响肉鸡的肝脏和肾脏功能[11]，但有研究表明，适量的蛋氨酸限制(饲粮蛋氨酸水平为NRC水平的60%～80%)能显著提高肉鸡肠道抗氧化能力，肠道先天性免疫系统基因表达，以及改善肠道菌群结构[12]。鉴于已有研究中蛋氨酸添加水平结论的不一致性，本试验探究补充或限制蛋氨酸对高饲养密度诱导的肉鸡氧化，应激状态的调节作用，研究在高密度条件下适宜的蛋氨酸水平，为集约化生产实践中蛋氨酸合理使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

选取1日龄AA肉鸡396只，1～21日龄统一饲喂于笼位面积为0.7 m2的上层笼子中，饲养密度为14只/m2，21日龄末选取体重相近的肉鸡随机分为5个处理。对照组饲养密度为14只/m2，饲粮蛋氨酸水平为0.40%；4个试验组饲养密度均为20只/m2，蛋氨酸水平分别设置为0.35%、0.40%、0.45%、0.50%。每个处理6个重复，每个重复1个笼位。试验分组见表1。

肉鸡的饲养管理、免疫程序按常规进行，自由饮水和采食。鸡舍温度在0～3日龄时为34 ℃，从4日龄后每周降低2～3 ℃，直至环境温度保持在22 ℃。光照程序为每天光照23 h，黑暗1 h。

1.2 饲粮组成与营养成分

试验基础饲粮配制参照鸡饲养标准(NY/T 33-2004)，肉鸡基础饲粮组成及营养水平见表2。基础饲粮中蛋氨酸水平为0.30%，对照组饲粮在基础饲粮中添加0.10%DL-蛋氨酸(99%)，试验饲粮在基础饲粮中分别添加0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的DL-蛋氨酸(99%)。

表1 试验处理及分组

表2 肉鸡基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能 试验肉鸡于21、42日龄空腹8 h后称量体重，统计饲喂量和剩料重，计算22～42日龄的平均日采食量、平均日增重和料重比，同时统计死亡率。

1.3.2 血液指标 在42日龄时，从每个重复选取1只接近平均体重的肉鸡翅静脉采血10 mL，抗凝处理，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，于-20 ℃保存待测以下指标:

血浆生化指标：谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)；血浆抗氧化指标：总抗氧化力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、蛋白质羰基(PCO)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)。以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。血浆应激指标：肌酸激酶(CK)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)，试剂盒购自南京建成生物工程研究所；皮质酮(CORT),采用ELISA法测定，试剂盒购自德国DRG公司，所用仪器为SM-3全自动酶免仪。

1.3.3 肝脏SOD、GSH-Px、HMGCR和HSP70基因表达 取肝脏组织于无RNA酶管在液氮中速冻，-80 ℃保存备用。待测基因引物信息见表3，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用Trizol Reagent提取肝脏组织总RNA，使用反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser)进行反转录；使用SYBR®Premix ExTaqTMⅡ试剂盒(Tli RNaseH Plus)进行实时荧光定量PCR反应。以上试剂盒均购自TaKaRa公司。以β-actin为内参基因，以2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。

表3 引物信息

续表

1.4 统计分析

采用SPSS 26.0统计软件中的独立样本t检验分析相同蛋氨酸水平时高、低密度处理效应；采用One-Way ANOVA分析所有处理间的差异，并对高密度处理下的4个蛋氨酸水平组做线性和二次曲线回归统计，分析蛋氨酸剂量效应对肉鸡的影响。结果以平均值±标准误表示。 当方差分析显著时，采用Tukey’s进行多重比较，P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 肉鸡生长性能

由表4可知，与正常密度组相比，高密度饲养显著降低了肉鸡42日龄体重、平均日采食量、平均日增重(P<0.05)，显著提高了肉鸡死亡率(P<0.05)，但对料重比无显著影响(P=0.460)。而与正常密度组相比，0.35%蛋氨酸组料重比显著提高(P<0.05)。在高密度饲养条件下，与0.40%蛋氨酸组相比，0.35%蛋氨酸组死亡率显著增加(P<0.05)，补充添加蛋氨酸至0.45%、0.50%死亡率显著降低(P<0.05)。

2.2 肉鸡氧化应激状态

2.2.1 肉鸡血浆生化指标 由表5可知，与正常密度组相比，高密度饲养显著提高了ALT活性(P<0.05)。在高密度饲养条件下，0.35%蛋氨酸组ALT活性显著高于0.40%和0.45%蛋氨酸组(P<0.05)；AST活性随着饲粮蛋氨酸水平的提高呈线性上升(P<0.05)；0.45%蛋氨酸组LDH活性显著高于其他各组(P<0.05)。

表4 不同处理组肉鸡生长性能(22～42日龄)

表5 不同处理组肉鸡血浆生化指标测定结果

2.2.2 肉鸡血浆抗氧化指标 由表6可知，与正常密度组相比，高密度组血浆T-AOC显著降低(P<0.05)，而SOD活性及PCO水平显著上升(P<0.05)。在高密度饲养条件下，随着蛋氨酸水平上升，PCO水平线性降低(P<0.05)。

2.2.3 肉鸡血浆应激相关指标 由表7可知，与正常密度饲养组相比，高密度饲养显著降低了TP浓度(P<0.05)。在高密度饲养条件下，与0.4%蛋氨酸水平组相比，0.5%蛋氨酸水平组TP浓度显著提高(P<0.05)；与0.40%和0.45%蛋氨酸水平组相比，0.35%水平蛋氨酸组血浆CK浓度显著降低(P<0.05)。

2.2.4 肉鸡肝脏抗氧化相关基因表达 由表8可知，与正常密度组相比，高密度饲养显著提高了肝脏HSP70基因表达(P<0.05)。与高密度正常氨酸组相比，高密度+0.35%蛋氨酸组、高密度+蛋氨酸0.50%组HSP70表达量显著提高(P<0.05)，高密度+0.45%蛋氨酸组无显著差异(P>0.05)。高密度+0.35%蛋氨酸组、高密度+0.50%蛋氨酸组HMGCR基因表达量均显著高于正常密度组(P<0.05)；肝脏组织中SOD、GPX转录水平在不同处理间均无显著差异(P>0.05)。

表6 不同处理组肉鸡血浆抗氧化指标测定结果

表7 不同处理组肉鸡血浆应激指标测定结果

表8 不同处理组肉鸡肝脏抗氧化相关基因mRNA表达量

3 讨 论

3.1 饲养密度和不同蛋氨酸水平对肉鸡生产性能的影响

大量研究表明，高饲养密度会降低肉鸡体增重和采食量[13-14]，还会显著提高肉鸡死亡率[15-16]，本试验结果与之一致。原因可能是多方面的，高密度饲养条件下，空气流动不良，单位面积鸡群呼吸产热增加[17]，鸡舍在较高的温度和湿度下不利于肉鸡生长[18]，鸡舍环境恶化极易增加肉鸡胸囊肿和腿部疾病发生率[19]。已有研究表明，添加蛋氨酸可以降低动物死亡率[20]。在本试验中，高密度饲养组在额外补充蛋氨酸后显著降低了肉鸡死亡率，而高密度+蛋氨酸限制组的死亡率显著高于其他组，这可能与蛋氨酸对禽类抗应激和抗氧化的积极影响有关[21]。

3.2 饲养密度和不同蛋氨酸水平对肉鸡血浆抗氧化指标的影响

机体在氧化状态下产生过量自由基，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞[22]。而SOD和GSH-Px可以通过清除自由基防止细胞氧化损伤。SOD能够催化自由基发生歧化反应，清除体内过多的超氧阴离子(O2-)，抑制氧自由基级联反应[23]。GSH-Px是一种重要的过氧化物分解酶，能提高机体分解过氧化产物的能力，伴随还原态GSH变为氧化态GSSG[24]。当自由基未及时清除时，会导致脂质过氧化产物MDA和蛋白过氧化产物PCO的积累，这两种产物可用于衡量机体被氧化的程度[25]。在本试验中，高密度饲养组血液T-AOC下降，同时PCO水平上升，表明肉鸡产生了氧化应激。蛋氨酸产物半胱氨酸作为谷胱甘肽的前体，在抗氧化过程中发挥重要作用。机体氧化应激会产生大量活性氧(ROS)，ROS经过芬顿反应形成的羟自由基可以通过攻击多不饱和脂肪酸生成4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)和4-羟基己烯醛(4-hydroxyhexenal,4-HHE)。当体内4-HNE和4-HHE过多时，会使蛋白质的半胱氨酸羰基化[26-27]，形成PCO。 当机体发生氧化应激时，ROS产量增加，并激活AP1和核转录因子κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB)，增加SOD活性来抵抗细胞损伤[28]。但大量表达的SOD能表现出过氧化物酶活性，催化H2O2产生羟基自由基，对机体造成损害[29]。Sarah等[30]指出，蛋氨酸有明显的抗氧化功能，可通过减少线粒体中ROS的产生而降低细胞氧化应激。本试验中，高密度+蛋氨酸限制组PCO浓度最高，随着蛋氨酸水平的提高，PCO浓度线性降低。蛋氨酸可能通过抑制蛋白质羟基化而减轻机体氧化应激程度[31]。有趣的是，在高密度饲养组，随着饲粮蛋氨酸添加水平的上升，脂类过氧化产物MDA含量没有显著变化，GSH-Px作为清除脂类氢过氧化物的主要酶[32]，也没有显著变化，并且高密度饲养对GSH/GSSG也没有任何影响。原因可能是SOD的高表达消耗了过多的H2O2，从而导致主要作用于H2O2的GSH-Px在高密度饲养组没有产生显著差异[33]。另一方面，密度应激可能对蛋白质过氧化更加敏感，而饲粮中的蛋氨酸大部分用于合成蛋白质来满足机体需要[34]。

3.3 饲养密度和不同蛋氨酸水平对肉鸡血浆应激指标的影响

研究表明，应激反应主要是通过下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)实现的，而CORT含量升高可作为应激反应的标志[35]。CK在细胞中的作用主要是生成ATP保证供能[36]，有研究表明，肉鸡在应激状态时CK会从肌细胞逸入血液，血液中CK活性升高表示机体组织细胞发生损伤[37]。本试验中，高密度饲养可提高肉鸡血液CORT浓度及CK活性，但没有达到显著水平。但当限制饲粮蛋氨酸水平时，CK活性显著低于0.40%、0.45%蛋氨酸组，说明限制饲粮蛋氨酸水平可以有效抑制高密度饲养下肉鸡发生机体细胞损伤。血液TP含量受多种因素影响，其含量可以间接反映肠道对饲料蛋白质的消化吸收程度以及利用率[38]。与正常组相比，高密度饲养显著降低了TP浓度，而TP浓度随着蛋氨酸水平的上升极显著提高，PCO趋势则与之相反。表明机体受到高密度氧化应激的影响，对饲料蛋白质的利用率下降，而蛋氨酸可以减轻过氧化的影响，提高蛋白质利用率[39]。

3.4 饲养密度和不同蛋氨酸水平对肉鸡肝脏损伤的影响

肝脏是重要的代谢和免疫器官，当体内过氧化反应水平较高，会导致肝脏代谢出现异常，肝细胞受损后，主要存在于肝细胞中的ALT和AST会因细胞膜和线粒体结构破坏而从细胞逸出，再进入血液，使血清中ALT、AST活性升高[40]。LDH与肝脏衰竭有关，作为治疗急性肝衰竭的靶点，可用于评估肝脏损伤程度[41]。HSP70作为主要的热休克蛋白，可诱导性最强，它主要发挥分子伴侣功能，能够结合错误折叠的蛋白质并协助其正确折叠，从而快速适应细胞内环境变化。在应激条件下，其表达量会快速增加[42-43]。在本试验中，高密度饲养组的肝脏HSP70 mRNA表达显著上调，血液中ALT活性显著提高，表明肉鸡肝脏受到应激损伤，导致ALT从肝细胞逸出，而HSP70在应激情况下被激活且高度表达，有益于抑制肝脏代谢的异常[44]。随着饲粮中蛋氨酸水平的增加，血液AST和ALT活性呈显著的线性提高，表明肝细胞受损程度加深。此外，肝脏HSP70的表达也随着蛋氨酸水平的增加而显著上调，这是机体抗损伤能力加强的表现[45]。高水平的胆固醇是心血管疾病、非酒精性脂肪肝、肥胖和糖尿病的主要危险因素，HMGCR表达量则能代表体内胆固醇合成速率[46]。HMGGR基因表达量在高密度饲养条件下无显著差异，但是与正常密度对照组相比，饲粮蛋氨酸限制组和0.50%蛋氨酸组都提高了肝脏HMGGR表达，表明饲粮蛋氨酸水平过低或者过高可能都会导致体内胆固醇代谢上升，对肉鸡生产造成不利影响。

4 结 论

本试验条件下，饲养密度与蛋氨酸添加水平对肉鸡的生产性能、应激程度、抗氧化能力均产生了一定影响，高密度饲养可引起肉鸡的应激反应和肝脏损伤。在高密度饲养条件下，限制饲粮蛋氨酸水平会降低肉鸡对蛋白质的利用，使料重比和死亡率升高；而蛋氨酸水平较高(0.50%)时也会产生一定的肝脏损伤；饲粮蛋氨酸水平在0.45%时有较好的抗应激、抗氧化效果，有益于肉鸡生长。