基于网络药理学探讨白龙散治疗鸡腹泻的作用机制

王小莹，李秀梅，王秀敏，刘魏魏，杨 娟，田 薇，周炜炜，戴小枫

(1.中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京 100081；2.天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

近年来随着养鸡业的快速发展，鸡场逐渐规模化和标准化，但在饲养管理、消毒卫生、传染病防治等方面仍存在各种问题[1]，易造成鸡腹泻等疾病的发生与蔓延[2-3]。鸡常见的腹泻类型包括中毒性腹泻、细菌性腹泻、病毒性腹泻、寄生虫性腹泻、代谢性腹泻和营养性腹泻等[4-5]。虽然抗生素可防治鸡群腹泻，改善饲料利用率，促进鸡的生长[6-7]，但由于抗生素的过度使用和滥用，细菌极易产生耐药性，从而导致“超级细菌”产生[8]，严重危害人类和动物的健康。为避免这些情况的发生，2020年7月，中国正式禁止饲料生产企业生产含有促生长类药物(除中药外)添加剂的商品饲料。“禁抗令”的施行推动了绿色安全替代产品的开发[9]。此外，中药具有毒副作用低、无耐药性、功能多样、抗腹泻效果等优点[10-12]。因此，从中药复方中寻找一种可替代抗生素治疗鸡腹泻的方法成为研究者关注的焦点[13]。

白龙散是由白头翁(20 g)、龙胆(10 g)、黄连(10 g)3种中药组合而成的复方[14]，据2020年版《中华人民共和国药典》[15]记载，白头翁为毛茛科植物白头翁(PulsatillachinensisBge.)的干燥根，其味苦性寒[16]，归胃、大肠经，有清热解毒、凉血止痢的功效，临床上用于治疗热毒血痢、阴痒带下；黄连为毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch.)、三角叶黄连(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云连(CoptisteetaWall.)的干燥根茎，其味苦性寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，功效为清热燥湿、泻火解毒；龙胆为龙胆科植物条叶龙胆(GentianamanshuricaKitag.)、龙胆(GentianascabraBge.)、三花龙胆(GentianatrifloraPall.)或坚龙胆(GentianarigescensFranch.)的干燥根和根茎，其味苦性寒，归肝、胆经，有清热燥湿、泻肝胆火的功效。白龙散可通过抑制大肠杆菌、志贺氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌[17]等的生长达到治疗雏鸡白痢[18]、仔猪黄痢[19]、羔羊痢疾[20]的目的。但白龙散作为中药复方，其药物组成较多，有效成分复杂，作用靶点多，作用机制尚不明确。本研究拟通过网络药理学方法揭示中药复方白龙散治疗鸡腹泻的潜在分子机制，从而为白龙散的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 白龙散活性成分-靶点网络图的构建

利用TCMSP数据库(https:∥old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)筛选白龙散(白头翁、龙胆、黄连)的所有化学成分，筛选阈值设定为口服生物利用度(OB,oral bioavailability)≥30%及类药性(DL,drug-like index)≥0.18，利用所筛选的活性成分收集对应的潜在作用靶点，将所有潜在作用靶点导入Uniprot数据库(https:∥www.uniprot.org/)中进行标准化处理并设置物种为“Gallusgallus”，查询得到基因简称，利用Cytoscape_3.8.0软件构建白龙散活性成分-潜在作用靶点网络图。

1.2 白龙散治疗鸡腹泻的关键靶点蛋白互作(PPI)网络图的构建

利用GeneCards数据库(https:∥www.genecards.org/)和OMIM数据库(https:∥omim.org/)以“Gallusdiarrhea”为关键词搜索疾病靶点数据集，获取鸡腹泻相关的基因，将2个数据库得到的基因合并去重后得到鸡腹泻的相关靶点。使用Venny 2.1软件(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取白龙散药物靶点和鸡腹泻疾病靶点的交集，运用Cytoscape_3.8.0软件构建白龙散-活性成分-靶点和鸡腹泻疾病-靶点的可视化网络图。将交集靶点导入STRING数据库(https:∥www.string-db.org/)中，设置物种为“Gallus”，置信度≥0.04，获取相应的蛋白相互作用信息，并对关键靶点蛋白进行分析。

1.3 GO功能注释及KEGG通路富集分析

将白龙散作用于鸡腹泻的关键靶点蛋白上传至DAVID数据库(https:∥david.ncifcrf.gov/tools.jsp)进行功能注释和富集分析，以探讨其治疗鸡腹泻的作用靶点和信号通路。

2 结 果

2.1 白龙散活性成分-靶点网络图的构建

通过TCMSP共筛选得到168个活性成分，其中白头翁57个，龙胆63个，黄连48个。根据OB≥30%、DL≥0.18筛选标准后，共得到27个活性成分，其中白头翁9个，龙胆8个，黄连10个，检索27个活性成分筛选去重后共获得57个潜在作用靶点。利用Cytoscape_3.8.0软件构建并分析白龙散活性成分-靶点网络图(图1)，结果发现连接度较高的有黄连中的槲皮素(40)，龙胆中的山奈酚(15)、白头翁中的异鼠李素(12)，还有Beta-谷固醇(10)、金鱼草素(7)、豆固醇(7)、R型氢化小檗碱(7)等(表1)。

三角代表中药，黄色、红色、蓝色的菱形代表白头翁、黄连、龙胆的活性成分，椭圆形代表白龙散潜在作用靶点。图3同Triangle represents the traditional Chinese medicine,the yellow,red and blue diamonds represent the active ingredients of Pulsatillae Radix,Coptidis Rhizoma and Gentianae Radix et Rhizoma,and the ellipse represents the potential target of Bailongsan.The same as fig.3图1 白龙散活性成分-靶点网络图Fig.1 Active ingredients-target network of Bailongsan

表1 白龙散的主要活性成分

续表

2.2 白龙散治疗鸡腹泻的关键靶点PPI网络图的构建

通过GeneCards、OMIM数据库分别检索得到4 060和413个鸡腹泻的相关基因，去重后共得到4 207个疾病靶点。venn分析得到45个交集靶点(图2)，利用Cytoscape_3.8.0软件构建白龙散-活性成分-靶点和鸡腹泻疾病-靶点的可视化网络图(图3)。将45个交集靶点导入STRING软件平台后得到PPI网络图后利用Cytoscape_3.8.0软件进行可视化(图4)。根据Degree值列举白龙散治疗鸡腹泻的靶点，结果见表2。由表2可知，白龙散药物靶点与鸡腹泻靶点中转录因子AP-1(transcription factor AP-1,JUN)、原癌基因蛋白质类C(Myc proto-oncogene protein，MYC)、雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)、B细胞淋巴瘤2家族蛋白1(Bcl-2-like protein 1，BCL2L1)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、G1/S-specific周期蛋白D1(G1/S-specific cyclin-D1，CCND1)等互作的频率较大。

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

通过DAVID在线数据库对关键靶点蛋白进行GO功能富集分析，确定了112条GO条目，其中生物过程主要涉及细胞增殖、正调控IL-12的产生、蛋白水解作用、对病毒的防御反应、消化道形态发生、炎症反应等76个；细胞组分主要涉及到胞质、细胞核、核染色质等13个； 分子功能主要涉及类固醇绑定、甾类激素绑定、雌激素受体的活动、DNA结合、蛋白结合等23个(图5)。KEGG通路分析结果发现，主要涉及细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤抑制蛋白(tumor suppressor gene，p53)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等22条信号通路(图6)。综合比较分析发现，白龙散中有效化学成分可作用于核染色质和细胞质中炎症反应、类固醇绑定、甾类激素绑定等多个生物过程和细胞因子-细胞因子受体相互作用、p53信号通路、MAPK信号通路等多条信号通路，达到治疗鸡腹泻的目的。

图2 白龙散与鸡腹泻交集靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of intersection targets of Bailongsan and chicken diarrhea

图3 白龙散活性成分-靶点和鸡腹泻疾病-靶点网络图Fig.3 Network diagram of Bailongsan active ingredients-targets and chichen diarrhea disease-targets

依据度值作图，度值越大，靶点的面积越大According to the degree,the larger the degree value,the larger the target area图4 白龙散治疗鸡腹泻关键靶点的PPI网络图Fig.4 PPI network of key targets of Bailongsan in treatment of chicken diarrhea

表2 白龙散治疗鸡腹泻STRING网络关键靶点

3 讨 论

鸡腹泻作为养鸡场常见的群发性疾病在全国各地养鸡场广泛发生，已成为疾病防治中的重点研究对象之一，同时造成鸡腹泻的原因较多，为该病的防治带来许多困难[21]。白龙散由白头翁、黄连和龙胆3味中药组成，其功效为清热燥湿、凉血止痢，可用于治疗湿热泻痢、热毒血痢[22]，可见其在治疗热泻、痢疾方面有良好的作用。

本研究通过网络药理学方法，利用OB和DL值筛选得到白龙散中27个活性成分。金鱼草素、异鼠李素、槲皮素、异牡荆素、日当药黄素、山奈酚等黄酮类化合物能显著提高动物生产性能和机体抗病力,并改善动物机体免疫机能[23]；其中，槲皮素具有抗炎活性，可通过改变腹腔毛细血管和肠黏膜的通透性，减少肠道水分和电解质的分泌，以达到治疗腹泻的目的[24]。小檗碱、小檗红碱、表小檗碱、R型氢化小檗碱、小檗浸碱、黄连碱、巴马汀、甲基黄连碱等生物碱类化合物具有抗菌、抗病毒作用[25]；其中，小檗碱具有抗菌消炎、调节机体免疫、修复肠道屏障等作用[26]；巴马汀能减少肠道炎症[27]。导致鸡腹泻的部分原因是机体感染病毒或细菌，而具有抗菌、抗病毒等作用的活性成分能抑制微生物生长，从而有效治疗腹泻。β-谷甾醇、豆固醇、谷甾醇等甾体类化合物具有良好的抗炎活性[28]。龙胆中的芝麻素属于脂素类化合物，具有抗氧化、抗炎、调脂、保护肝肾及心血管系统、抗肿瘤等作用[29]。鸡腹泻会引起炎症反应，具有良好的抗炎活性能缓解机体炎症，从而改善鸡腹泻。可见，白龙散有效成分主要是通过抗炎、抗菌等作用来达到改善鸡腹泻的目的。

PPI网络结果表明JUN、MYC、ESR1、IL-6、前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)等是治疗鸡腹泻的关键靶点。JUN是哺乳动物二聚体转录因子AP-1亚基之一，AP-1是位于JNK下游的关键信号蛋白分子，与炎症反应密切相关[30]。MYC是MYC原癌基因蛋白，与炎症组织损伤和修复方面有关[31]。ESR1是雌激素受体，有研究报道ESR1可与NF-κB间以细胞类型特异性的方式发生相互抑制[32]，降低NF-κB的DNA结合活性，抑制NF-κB介导的IL-6启动子的转录，并取代启动子中的RELA/p65和相关的辅助调节因子[33]。IL-6在免疫、组织再生和代谢方面具有广泛生物学功能[34]，其表达水平在感染、创伤或损伤后迅速上升，导致炎症反应[35]。PTGS2是前列腺素生物合成途径中的双环氧合酶和过氧化物酶，在各种细胞中可被促炎细胞因子、肿瘤促进剂、有丝分裂原和生长因子等高度诱导，从而参与炎症反应、细胞增殖和凋亡等多种病理过程[36]。综上，JUN、MYC、ESR1、IL-6、PTGS2等靶点与炎症反应有关，这表明白龙散可能会通过作用于炎症相关的靶点来治疗鸡腹泻。

图5 白龙散治疗鸡腹泻的关键靶点的GO功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis of key targets of Bailongsan in the treatment of chicken diarrhea

图6 白龙散-鸡腹泻关键靶点基因KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Bailongsan in treatment of chicken diarrhea

GO功能和KEGG通路富集分析结果表明，白龙散治疗鸡腹泻涉及多条生物学过程和信号通路，根据P值得到细胞因子-细胞因子受体相互作用、p53信号通路、MAPK信号通路等主要信号通路。细胞因子是细胞间重要的调节因子和细胞动员因子，参与先天和适应性炎症宿主防御、细胞生长、分化、死亡及恢复稳态的发育和修复过程[37]。有研究报道,鸡感染禽致病性大肠埃希菌后，IL-8、IL-1β、CCL19等基因表达量上升，参与细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路中的炎症反应[38]。 p53作为肿瘤抑制基因与炎症的主要调节因子NF-κB相互负调控，且p53信号通路可通过p53负调控NF-κB、TLR-4及TRAF6基因的表达，从而抑制NF-κB信号通路的活化[39-40]。MAPK信号转导途径可以介导单核细胞、内皮细胞和中性粒细胞等免疫细胞p38的激活，从而引起炎性反应[41]。上述信号通路与炎症反应相关，进一步证明了白龙散可能是通过参与炎症反应相关的信号通路来治疗鸡腹泻。

4 结 论

本研究通过TCMSP数据库筛选得到白龙散中3味中药活性成分的潜在作用靶点，利用STRING和Cytoscape软件、在线维恩图、DAVID数据库构建白龙散与腹泻的靶点的相互作用网络图，预测了关键靶点和通路，对中药复方白龙散治疗鸡腹泻进行了网络分析。白龙散治疗鸡腹泻的分子机制可能主要通过槲皮素、山奈酚、异鼠李素等调控JUN、MYC、ESR1、IL-6等靶点，经由细胞因子-细胞因子受体相互作用、p53信号通路、MAPK信号通路等信号通路来实现。但由于中药成分复杂，鸡腹泻病因尚未知，白龙散治疗鸡腹泻的实际作用靶点和信号通路有待进一步试验验证。