瑞舒伐他汀抑制miR-122-5p减轻LPS诱导的神经细胞损伤

罗凯 段华彬 罗明鼎 宋世杰 舒宇辉

脊髓损伤是造成瘫痪和感觉障碍的主要原因，不仅给患者带来严重的身体及心理创伤，还给患者家庭造成极大的经济负担。研究显示，神经细胞过度的氧化应激和炎性反应、神经递质蓄积、神经轴突损失、神经细胞凋亡等均可引起脊髓损伤[1]。因此，寻找能够改善神经损伤的的药物对预防和治疗脊髓损伤十分必要。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是临床常用的调节血脂的药物，具有较好的降脂效果。研究显示，瑞舒伐他汀可能通过抑制Sphk1-S1P信号传导通路介导的的炎性因子表达来减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤，延缓动脉粥样硬化进程[2]；瑞舒伐他汀可抑制氧糖剥夺/复氧诱导的脑微血管内皮细胞凋亡，减轻细胞损伤，具有维持血脑屏障的潜在价值[3]。但目前，瑞舒伐他汀对神经细胞损伤的影响尚笔者未见报道。miR-122-5p是一种微小RNA(miRNA)，参与调控细胞凋亡、炎性反应和氧化应激等生理或病理过程，在多种疾病发生发展中起重要作用[4,5]。有报道，miR-122-5p在乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤中表达升高，靶向下调其表达可减轻小鼠肝损伤[6]。miR-122-5p对神经细胞损伤的影响也还未知。因此，本研究以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12为研究对象，采用脂多糖(LPS)诱导PC-12细胞建立神经细胞损伤模型，观察瑞舒伐他汀对神经细胞损伤的影响及其能否调控miR-122-5p发挥作用，以期为神经损伤性疾病的治疗提供新方法。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤株PC-12，上海通派生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技公司；DMEM培养基、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒，北京索莱宝公司；LPS，美国Sigma公司；LipofectamineTM2000试剂盒和Trizol试剂，美国Invitrogen公司；miR-122-5p模拟物(mimics)、模拟对照序列(miR-NC)、miR-122-5p抑制剂(anti-miR-122-5p)、抑制剂阴性对照序列(anti-miR-NC)和PCR引物，上海生工生物工程有限公司；兔抗人活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspases-3)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体，美国Santa Cruz公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒，大连宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染:复苏PC-12细胞，用含10% FBS的DMEM培养基培养。当细胞生长密度至80%时，0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。将对数生长期的PC-12细胞以5.0×105个/孔接种于6孔板中，采用LipofectamineTM2000脂质体法，分别转染miR-NC、miR-122-5p mimics。转染6 h后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞备用。

1.2.2 细胞分组处理:未转染的PC-12细胞分为对照组(NC组)、LPS组、0.01 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS组、0.1 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS组和1.0 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS组，其中NC组细胞常规培养基培养，LPS组细胞用含1.0 mg/ml[7]LPS的培养基培养，0.01 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS组、0.1 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS组和1.0 μmol/L 瑞舒伐他汀+LPS组细胞分别用含0.01、0.1、1.0 μmol/L[8]的瑞舒伐他汀与1.0 mg/ml LPS共同培养。转染miR-NC、miR-122-5p mimics的细胞均用含1.0 μmol/L的瑞舒伐他汀与1.0 mg/ml LPS共同培养，分别记为miR-NC+1.0 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS组、miR-122-5p+1.0 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS组。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖:将未转染、转染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12细胞均以1.0×104个/孔接种于96孔板中，5组中每组设3个复孔。培养24 h后，加10 μl CCK-8试剂。再孵育1.5 h后，酶标仪450 nm检测吸光度(A)值。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡:将未转染、转染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12细胞均以2.5×104个/孔接种于24孔板中，每组设3个复孔。培养24 h后，收集细胞，PBS清洗2次，并调整细胞浓度为2.5×104个/ml。取1.0 ml细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清。加500 μl结合缓冲液，重悬细胞。加10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室温避光孵育15 min 后，上流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blot法检测Cleaved-caspase-3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达:将未转染、转染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12细胞均以2.5×104个/孔接种于24孔板中，每组设3个复孔。培养24 h后，收集细胞，PBS清洗2次。RIPA试剂提取细胞中总蛋白，BCA法检测蛋白含量，以每孔20 μg蛋白行SDS-PAGE电泳。电泳后，将分离蛋白转移至PVDF膜，并于5 %脱脂奶粉中封闭1 h。然后分别于Cleaved-caspase-3(1∶1 000)、IL-1β(1∶500)、IL-6(1∶500)、TNF-α(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育液中4℃过夜。再于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中37℃孵育1 h。加显影液避光显影，曝光拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.6 RT-qPCR检测miR-122-5p表达:将未转染、转染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12细胞均以2.5×104个/孔接种于24孔板中，每组设3个复孔。培养24 h后，收集细胞，PBS清洗2次。Trizol试剂提取细胞中总RNA，逆转录为cDNA后，行PCR扩增。引物序列：miR-122-5p上游5’-GGAGAGAGCCCGGCGAGC-3’，下游5’-ACGAACTCTCGCGCCGG-3’；内参U6上游5’-CCCGAAGATAGCGCGGAG-3’，下游5’-CGATAGAGCGAGAGGG-3’。2-△△Ct法计算miR-122-5p相对于内参U6的表达水平。

2 结果

2.1 瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞活力的影响 与NC组比较，LPS组PC-12细胞A值降低(P<0.05)。与LPS组比较，不同浓度(0.01、0.1、1.0 μmol/L)瑞舒伐他汀+LPS组PC-12细胞A值升高(P<0.05)。见表1。

表1 瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞活力的影响

2.2 瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞凋亡的影响 与NC组比较，LPS组PC-12细胞凋亡率升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。与LPS组比较，不同浓度(0.01、0.1、1.0 μmol/L)瑞舒伐他汀+LPS组PC-12细胞凋亡率降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05)。见表2，图1。

表2 瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞凋亡的影响

图1 瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞凋亡的影响；A Western blot检测Cleaved-caspase-3蛋白的相对表达；B 流式细胞仪检测细胞凋亡

2.3 瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞炎性因子表达的影响 与NC组比较，LPS组PC-12细胞中IL-1β蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表达水平升高(P<0.05)。与LPS组比较，不同浓度瑞舒伐他汀+LPS组PC-12细胞中IL-1β蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表达水平降低(P<0.05)。见表3，图2。

图2 Western blot检测IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的相对表达

表3 瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞炎性因子表达的影响

2.4 瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞中miR-122-5p表达的影响 与NC组比较，LPS组PC-12细胞中miR-122-5p表达水平升高(P<0.05)。与LPS组比较，不同浓度(0.01、0.1、1.0 μmol/L)瑞舒伐他汀+LPS组PC-12细胞中miR-122-5p表达水平降低(P<0.05)。见表4。

表4 瑞舒伐他汀对miR-122-5p表达的影响

2.5 上调miR-122-5p逆转瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞活性、凋亡及炎性因子表达的影响 与miR-NC+1.0 μmol/L 瑞舒伐他汀+LPS组比较，miR-122-5p+1.0 μmol/L 瑞舒伐他汀+LPS组PC-12细胞中miR-122-5p水平升高(P<0.05)，细胞A值降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)，IL-1β蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表达水平升高(P<0.05)。见表5，图3。

表5 上调miR-122-5p逆转瑞舒伐他汀对LPS处理的PC-12细胞活性、凋亡和炎性因子表达的影响

图3 Western blot检测Cleaved-caspase-3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表达

3 讨论

脊髓损伤包括初次打击和二次损伤，其中二次损伤主要为神经细胞损伤，预防和减轻神经损伤对改善脊髓损伤患者预后具有重要意义[9]。PC-12细胞是从大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆而来的细胞系，在细胞生长因子的诱导下可分化为神经样细胞，且具有良好的神经细胞特性，常被用作探究神经系统疾病的模型细胞[10]。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，能够诱导细胞产生过度的炎性反应，严重时可引起细胞凋亡，是细胞损伤的常用诱导剂[11]。本研究显示，PC-12细胞经LPS诱导后，其活性降低，而凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平明显升高，与相关报道结果[7]一致，说明LPS诱导的PC-12细胞损伤模型建立成功。

瑞舒伐他汀是一种他汀类药物，主要用于治疗高胆固醇血症，也可用来预防心血管疾病。研究显示，瑞舒伐他汀可能通过抑制TLR4/NFκBp65信号通路减少LPS诱导人外周血晚期内皮祖细胞ROS的生成和氧化损伤[12]。瑞舒伐他汀抑制柯萨奇B3病毒诱导的小鼠心肌细胞凋亡和炎性反应，改善心脏功能，对小鼠病毒性心肌炎具有保护作用[13]。本研究显示，一定剂量(0.01、0.1、1.0 μmol/L)的瑞舒伐他汀可有效提高LPS诱导的PC-12细胞活性，并减少其凋亡。细胞凋亡是一种神经细胞损伤的表现形式，其受多种基因分子的调控。Caspases级联反应参与细胞凋亡，caspases-3是该级联效应的关键调控分子，其在受到上游凋亡刺激信号后活化形成Cleaved-caspases-3，进而介导蛋白剪切，引起染色质固缩，导致细胞凋亡[14]。本研究显示，瑞舒伐他汀可降低LPS诱导的PC-12细胞中Cleaved-caspases-3蛋白的表达，亦表明其抑制了LPS诱导的PC-12细胞损伤，减轻了细胞损伤。

脊髓损伤过程中伴有大量促炎因子的生成和释放，这些炎性因子可加重脊髓损伤。IL-1β可介导中性粒细胞浸润，加重损伤区域的炎性反应[15]。IL-6是机体应对感染和组织损伤产生的重要介质，参与炎性反应[16]。TNF-α是巨噬细胞分泌的具有多种生物学效应的细胞因子，可激活炎症细胞参与炎性反应，介导免疫应答[17]。研究表明，脊髓损伤后，IL-1β、IL-6和TNF-α的表达明显增加[18]。本研究显示，瑞舒伐他汀降低了LPS诱导的PC-12细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达，说明瑞舒伐他汀可减弱LPS诱导的神经细胞炎性反应，减轻神经细胞炎性损伤。

miRNA在真核生物中广泛存在，参与调节神经细胞凋亡、炎性反应和氧化应激等生命活动，与神经损伤性疾病的发生发展密切相关。miR-122-5p作为一种miRNA，参与多种疾病的发展进程。研究显示，慢性乙型肝炎肝损伤患者血清中miR-122-5p表达升高，其诊断慢性乙型肝炎肝损伤的敏感度为83.3%，特异性为73.3%，可作为诊断慢性乙型肝炎患者肝损伤生物标志物[19]；miR-122-5p拮抗剂可抑制脂多糖诱导小鼠肺微血管内皮细胞炎症、凋亡和氧化应激，miR-122-5p通可能是急性肺损伤的潜在治疗靶点[20]。本研究显示，LPS诱导PC-12细胞后细胞中miR-122-5p表达水平升高，提示miR-122-5p可能参与LPS诱导的PC-12细胞损伤；而瑞舒伐他汀抑制了LPS诱导的PC-12细胞中miR-122-5p的表达，且上调miR-122-5p表达逆转了瑞舒伐他汀对LPS诱导的PC-12细胞凋亡及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达的抑制作用，提示瑞舒伐他汀可能通过下调miR-122-5p表达来抑制LPS诱导的PC-12细胞损伤。

综上所述，瑞舒伐他汀可提高LPS诱导的PC-12细胞增殖活性，抑制细胞凋亡及炎性因子的表达，其作用机制可能与下调细胞中miR-122-5p的表达有关，具有减轻神经细胞损伤、治疗脊髓损伤的潜在作用。