大林姬鼠和黑线姬鼠肠道菌群的比较与分析

张春凤 苏航 周思宇 杨文建 于成文 金志民

摘    要：为了探究大林姬鼠和黑线姬鼠肠道微生物的组成及是否有显著差异，采用高通量测序技术对10只大林姬鼠和10只黑线姬鼠的肠道菌群的组成进行了初步分析，并比较两组之间肠道菌群的差异。结果表明，两种鼠的肠道菌群在门水平上以厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门为主。在属水平上，大林姬鼠的优势菌属为unidentified-Muribaculace、unidentified- Lachnospiraceae、螺杆菌属，黑线姬鼠的优势菌属为unidentified-Lachnospiraceae、unidentified-Muribaculace、乳杆菌属。Anosim分析结果表明，大林姬鼠与黑线姬鼠肠道菌群的组间差异大于组内差异，且两组间肠道菌群差异极显著（P<0.01）。本研究结果为防治农林有害微生物和有效评估鼠类疾病传播风险提供基础微生物数据。

关键词：大林姬鼠;黑线姬鼠;肠道菌群;16S rDNA;高通量测序

中图分类号：Q95         文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.03.003

Comparison and Analysis of the Intestinal Flora of Apodemus peninsulae and Apodemus agrarius

ZHANG Chunfeng1，SU Hang2，ZHOU Siyu2，YANG Wenjian2， YU Chengwen2，JIN Zhimin2

（1.Heilongjiang Agricultural Economy Professional College，Mudanjiang，Heilongjiang 157041，China;2. School of Life Science and Technology，Mudanjiang Normal University，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China）

Abstract： To investigate the composition of intestinal microorganisms of Apodemus peninsulae and Apodemus agrarius and whether there is significant difference，the composition of intestinal flora of 10 A. peninsulae and 10 A. agrarius was preliminarily analyzed by high-throughput sequencing technique， and the difference of intestinal flora between the two groups was compared. The results showed that， at the phylum level， the intestinal flora of the two species of rats was dominated by Firmicutes， Bacteroidetes and Proteobacteria. At genus level， the dominant genus of A. peninsulae was unidentified-Muribaculace、unidentified-Lachnospiraceae、Helicobacter， the dominant genus of A. agrarius is unidentified-Lachnospiraceae、unidentified-Muribaculace、Lactobacillus. The results of Anosim analysis showed that the inter-group differences in intestinal flora of A. peninsulae and A. agrarius were greater than the intra-group differences， and the differences in intestinal flora between the two groups were extremely significant （P<0.01）. The results of this study will provide basic microbial data for controlling harmful microorganisms in agriculture and forestry and effectively assessing the risk of rodent-borne disease transmission.

Key words： Apodemus peninsulae; Apodemus agrarius; intestinal flora; 16S rDNA; high-throughput sequencing

大林姬鼠（Apodemus peninsulae）和黑線姬鼠（Apodemus agrarius）同属哺乳纲（Mammalia），啮齿目（Rodentia），鼠科（Muridae），姬鼠属（Apodemus），分类地位较为相近[1]。二者是我国农林地区的优势鼠种，形态外观相似，黑线姬鼠在体背面通常有一条显著的黑色纵纹，在取食倾向与栖息地选择上也有较大重叠[2-3]。目前，关于两种鼠在生态以及生理生化方面研究较多[4-6]，但关于两种鼠肠道菌群的组成及二者的差异报道还尚不充足。

微生物遍布在各种环境中，包括动物体表和体内，它们与其宿主互惠互利，密不可分，这种内在关联在动物肠道中表现的最为明显[7]。肠道微生物可以参与宿主的多种代谢途径，也被认为是另外的一种代谢器官，类似于肝脏[8]。肠道菌群是肠道微生物中的占比最大的组成部分，对宿主的生长和发育等许多方面起着重要作用，是宿主动物生存和适应环境的关键[9-11]。本文通过高通量测序技术研究大林姬鼠和黑线姬鼠肠道菌群的物种组成并对菌群功能进行预测，对两种鼠的数据进行比较分析，为探究影响肠道菌群组成的因素提供基础的微生物学数据，对有效防治农林有害微生物和评估鼠类疾病传播风险有重要参考价值。

1 材料和方法

1.1 样品的采集与保存

采用笼捕法，在黑龙江省牡丹江市横道河子国家自然保护区（海拔460～600 m， 44°44′～44°55′ N，129°06′～129°15′ E）内获得样本。选择健康成年大林姬鼠和黑线姬鼠各10只，雌雄各半，进行编号，如表1所示。在实验室无菌条件下，将鼠脱颈处死，并进行解剖，取出鼠的盲肠立即放入装有液氮的研钵中速冻，装入无菌冻存管，标记好放入-80 ℃冰箱。

1.2 样本总DNA的提取

采用CTAB/SDS方法，对两种鼠的肠道组织进行总DNA的提取。经过1.8%琼脂糖凝胶电泳20 min检测有明亮条带为提取成功。在每个样本的通用引物两端加上不同的barcode。使用通用引物515 F～806 R（515 F：5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，806 R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对16S rDNA 基因V3～V4区进行扩增。扩增条件如下：95 ℃（预变性）5 min;95 ℃（变性）30 s，50 ℃（退火）30 s，72 ℃（延伸）60 s，循环20次;72 ℃（延伸）5 min;将纯化产物送至北京百迈克生物科技有限公司用HiSeq2500PE 250平台进行双端测序。

1.3 数据处理

获得所有样本的测序数据后，首先去除引物接头序列，再通过重叠部分对每个样品的读取片段进行拼接，得到原始数据。使用Trimmomatic V 0.33对原始数据进行筛除，获得高质量的标签数据。使用 UCHIME v 4.2 软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终的有效数据。与数据库进行对比并将物种进行分类分析，绘制出样品在门水平与属水平下的群落结构图。

2 结果与分析

2.1 样品中有效序列和OTU数目

本研究通过高通量测序技术对大林姬鼠和黑线姬鼠的盲肠样本进行16S rDNA测序。共获得有效序列1 231 633条，其中大林姬鼠获得有效序列633 165条，黑线姬鼠获得598 468条有效序列。基于相似度>97%的原则將获得的有效tags序列进行聚类，共获得965个OTUs。韦恩图中重叠部分为所有样品共有的OTU数目，由图1可知20个样品中共有861个OTUs。

2.2 Alpha多样性分析

本研究通过对20份样品的Alpha多样性分析指数进行丰富度和多样性比较。本次样品文库的覆盖率 （coverage 指数）至少都在 99. 8% 以上，说明本次测序深度可以代表样品的真实情况。从图2可以看出，随着测试深度的不断加深，稀释曲线从不断上升，直至趋于平缓，说明样品的测序深度比较合理。

使用SPSS19.0软件对大林姬鼠组和黑线姬鼠组的Alpha 多样性指数进行差异性分析，结果如表2所示，两组的Ace、Chao1、Shannon、Simpson 4个指数均差异不显著（P>0.05），说明两种鼠肠道菌群的物种丰富度无显著差异。

2.3 物种分类分析

2.3.1 门水平菌群组成差异 由图3可知，在门水平上，大林姬鼠含量最高的5个菌门分别为厚壁菌门 （ Firmicutes ）占48.82% 、拟杆菌门（ Bacteroidetes）占28.85%、变形菌门（ Proteobacteria）占12.30%、Epsilonbacteraeota占6.99%、脱铁杆菌门（Deferri-

bacteres）占1.79%。黑线姬鼠含量最高的5个菌门分别为厚壁菌门（Firmicutes）占52.07% 、拟杆菌门（Bacteroidetes）占22.65%、变形菌门（Proteobacteria）占14.34%、Epsilonbacteraeota占4.79%、螺旋体门（Spirochaetes）占4.46%。由此可知，大林姬鼠与黑线姬鼠的优势菌门大致相同。

2.3.2 属水平菌群组成差异 由图4可知，在属水平上，大林姬鼠与黑线姬鼠肠道内各菌群存在比例有差异，大林姬鼠肠道内占比例最高的5个优势菌属依次为unidentified-Muribaculace占21.86%、unidentified-Lachnospiraceae占18.36%、螺杆菌属Helicobacter占6.99%、毛螺菌科NK4A136组（Lachnospiraceae-NK4A136-group）占5.66%、假单胞菌属Pseudomonas占5.52%。黑线姬鼠肠道内前5个优势菌属为unidentified-Lachnospiraceae占14.47%、unidentified-Muribaculace占12.87%、乳杆菌属（Lactobacillus）占7.76%、大肠埃氏菌属-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）占7.53%、毛螺菌科NK4A136组（Lachnospiraceae-NK4A136-group）占6.72%。

2.4 Anosim分析

Anosim 分析是一种非参数检验，基于Bray-Curtis 距离值的秩次进行每两组间差异显著性检验，用来判断组间差异是否大于组内差异。R-value 在（-1，1）之间， R-value > 0说明组间差异大于组内差异，R-value < 0则相反;P>0.05说明组间差异不显著，0.01

2.5 功能预测

使用PICRUSt软件通过比对16S rDNA测序数据获得的物种组成信息，推测样本中的功能基因组成。由图5可知，大林姬鼠和黑线姬鼠在一功能水平上共注释到6个功能，分别为代谢（Metabolism）、遗传信息处理（Genetic Information Processing）、环境信息处理（Environmental Information Processing）、细胞过程（Cellular Processes）、人类疾病（Human Diseases）、有机系统（Organismal Systems）。由图6可知，在功能水平上共注释到43个代谢功能，主要的代谢功能有全局和概述图（Global and overview maps）、碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism）、膜转运能量代谢（Membrane transportEnergy metabolism）、能量代谢（Energy metabolism）等。大林姬鼠和黑线姬鼠在肠道菌群KEGG数据库注释到的一功能层和二功能层均未发现显著差异。

3 结论与讨论

肠道菌群对宿主的生长和发育等许多方面起着重要作用，经过长期进化后，与宿主形成相互依赖、相互影响的统一体[12]。本研究采用 16S rDNA高通量测序技术来研究大林姬鼠与黑线姬鼠肠道菌群的组成。结果表明，大林姬鼠与黑线姬鼠均检测出11个菌门，前3个优势菌门均为厚壁菌门，拟杆菌门，变形菌门。厚壁菌门中的主要菌群都是发酵型细菌，可以利用碳水化合物生成乳酸，促进营养物质直接被宿主肠壁吸收，对肠道中的多糖也有代谢作用，有利于消化食物中的纤维素和半纤维素[13]。拟杆菌门可以帮助宿主从食物中获得能量，主要参与碳水化合物的发酵和分解多糖，细胞壁成分以及其他复杂的聚合物。变形菌门在对木质素的消化中起着重要的作用[14]。这一结果表明，大林姬鼠和黑线姬鼠的肠道菌群可以帮助宿主分解利用植物源食物，二者对植物源食物有较强的适应性。厚壁菌门、拟杆菌门以及变形菌门是啮齿动物肠道内的优势菌门，本试验的研究结果与其他啮齿动物肠道菌群组成研究结果大致相同，如甘肃鼢鼠，花鼠等[15-16]。

通过Anosim分析，得出大林姬鼠与黑线姬鼠的肠道菌群差异极显著。肠道菌群的组成与宿主基因型有关，Ley等人[17]研究发现leptin基因突变后的小鼠肠道菌群总数降低，且厚壁菌门与拟杆菌门的比例明显改变。Hildebrand等人[18]对5种大鼠肠道菌群进行分析比较发现相同遗传背景下的个体即使在不同环境中生长，其肠道菌群也有一定的相似性。除基因型外，肠道菌群的组成还受多种因素的影响，例如食性[19]、飼养方式[20]、年龄[21]、季节[16]、海拔[22]等。本文采用了同一时间、同一地点的成年大林姬鼠与黑线姬鼠样本，排除了季节、海拔、年龄因素。大林姬鼠与黑线姬鼠菌群差异极显著除宿主本身基因型不同外，还可能是因为二者的主要栖息地以及食物选择不完全相同。大林姬鼠主要分布在阔叶林和针阔混交林中，对植物茎叶、果实均有利用;黑线姬鼠在灌丛、农田草地、草甸分布较多，以农作物种子为主要食物[23]，但具体哪种因素造成二者肠道菌群有显著差异，还需进一步研究。本试验研究结果为更深层次探究啮齿动物体携带病原菌提供了重要依据，为农林有害微生物的防治以及评估鼠类传播疾病风险提供了基础微生物学数据。

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