固定化白腐真菌对复合污染废水的处理

黄仕元，李胜，王振宇，林森焕，邓简

(南华大学 土木工程学院，湖南 衡阳 421000)

抗生物残留可能导致耐药基因的产生与传播，对生态安全和人类健康存在潜在危害，是新型污染问题中最受关注的问题之一[1-2]。氟喹诺酮类抗生素使用后大部分会随尿液排出，是医院废水中含量较多的一类[3-4]。我国氟喹诺酮类抗生素使用量中诺氟沙星(NOR)占比很大。重金属生物毒性大，可在环境中长期存在且容易蓄积，进入人体后很难被代谢排出。

白腐真菌木质素酶高效、非特异性降解的特点使其广泛应用于废水处理研究[5]，另其细胞壁上含有大量官能团可与重金属离子络合[6]。因此本研究以白腐真菌模式菌种黄孢原毛平革菌为对象，研究其处理NOR和Cd2+复合污染废水的效果。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

诺氟沙星、氯化镉、葡萄糖、磷酸二氢钾等均为分析纯；菌种来源：黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium，BKMF-1767(CCTCC AF96007))购买自中国武汉菌种保藏中心。

IS-RDD3恒温振荡培养箱；GI54TW立式自动压力蒸汽灭菌锅；UV-2000紫外可见分光光度计；Agilent 1260高效液相色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 黄孢原毛平革菌对NOR和Cd2+的耐受性 分别制备含不同浓度(0，100，200，300，500 μg/L)的NOR和Cd2+的固体培养基(土豆培养基)，灭菌后分装至直径100 mm的培养皿中，冷却凝固后静置24 h，确保无污染后在无菌操作台点种黄孢原毛平革菌，在恒温培养箱30 ℃条件下培养96 h，每 24 h 观察测定培养皿中菌落直径。

1.2.2 模拟废水的制备 配制含NOR和Cd2+的液体培养基作为模拟废水，其中NOR和Cd2+的浓度均为100 μg/L。液体培养基参照Kirk培养基配制[7]：10 g葡萄糖(C6H12O6)，0.375 g MgSO4，2 g KH2PO4，0.2 g酒石酸铵(C4H12N2O6)，0.1 g CaCl2，2 mg维生素B1，0.006 4 g CuSO4，1 g/L吐温80，微量元素液20 mL，用蒸馏水定容至1 L，酒石酸缓冲液(20 mmol/L)调节pH。

1.2.3 制备固定化黄孢原毛平革菌菌球 称取一定量的海藻酸钠、沸石粉、粉末活性炭和二氧化硅在500 mL去离子水中充分混合均匀形成凝胶溶液。将黄孢原毛平革菌菌悬液与灭菌完成的凝胶剂溶液混合均匀，逐滴滴入CaCl2交联溶液中，交联2 h后过滤，用灭菌后的生理盐水冲洗若干次后分装至含适量液体培养基的锥形瓶中，在恒温振荡培养箱 30 ℃、150 r/min的条件下培养72 h后得固定化黄孢原毛平革菌小球(简称固定化黄孢菌菌球)。

1.2.4 固定化黄孢菌菌球对NOR和Cd2+的去除 分别考察不同投加量、葡萄糖浓度和Mn2+浓度条件下，固定化黄孢菌菌球对NOR和Cd2+的去除效果。

1.2.4.1 投加量 称取不同投加量(1，5，8，10，14 g)的固定化黄孢菌菌球加入装有模拟废水的锥形瓶中，温度30 ℃、转速150 r/min摇床下处理，过滤离心取上清液测定NOR和Cd2+的浓度。

1.2.4.2 葡萄糖浓度 配制葡萄糖含量分别为0，3，5，10 g/L的模拟废水，取一定量的固定化黄孢菌菌球分别加入装有模拟废水的锥形瓶中，温度 30 ℃、转速150 r/min摇床下处理，过滤离心取上清液测定NOR和Cd2+的浓度。

1.2.4.3 Mn2+浓度 配制Mn2+浓度分别为0，0.01，0.1，0.5 mmol/L的模拟废水，取一定量的固定化黄孢菌菌球分别加入装有模拟废水的锥形瓶中，温度30 ℃、转速150 r/min摇床下处理，过滤离心取上清液测定NOR和Cd2+的浓度。

1.3 分析方法

Cd2+的含量选用原子吸收分光光度计测定。NOR的含量选用高效液相色谱法测定，所用色谱柱：SHISEIDO C18 MG(250 mm×4.6 mm，5 μm)，色谱工作条件：柱温40 ℃，进样量10 μL，流速 1.0 mL/min，流动相为0.04 mol/L磷酸溶液-三乙胺和甲醇(80∶20，v/v)，波长280 nm，滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 黄孢原毛平革菌对模拟废水的耐受性

为考察黄孢原毛平革菌对NOR和Cd2+复合污染的耐受性，将其分别接种于添加了不同浓度(0，100，200，300，500 μg/L)的NOR和Cd2+的无菌固体培养基，观察测定黄孢菌菌落直径(图1)。

图1 菌落大小随时间的变化

由图1可知，随培养时间延长，各培养基上黄孢菌菌落直径不断增大，96 h均长满整个平板。未添加NOR和Cd2+的培养基菌落增长速度大于其他培养基，说明添加了NOR和Cd2+的培养基中菌落生长受到了抑制。而加入NOR和Cd2+的各培养基菌落增长速度差异很小，浓度为100 μg/L的培养基菌落略微大于其他浓度的培养基，说明黄孢原毛平革菌对较高浓度的NOR和Cd2+较敏感，因此本实验模拟废水中NOR和Cd2+浓度选用100 μg/L。

2.2 不同投加量对NOR和Cd2+去除效果的影响

图2是不同投加量对模拟废水中Cd2+去除效果影响的实验结果。当固定化黄孢菌菌球投加量分别为1，5，8，10，14 g时，Cd2+的去除率最高分别约50%，70%，82%，86%，93%，而投加8 g固定化无菌小球的去除率45%左右。

图2 投加量对镉离子去除的影响

由图2可知，Cd2+的去除率随固定化黄孢菌菌球投加量增加而增大，但投加量增加到一定程度后Cd2+去除率无显著变化，相对吸附量降低。有研究报道过镉离子去除的类似现象[8-9]，这可能是因为黄孢菌菌球投加量增加后吸附位点或者表面积增加，所以Cd2+去除率随之增加；但是投加量进一步增加后，黄孢菌菌球容易团聚而使有效表面积减少，表面官能团有效利用率下降，从而导致去除效果无显著变化。

固定化黄孢菌菌球投加量对NOR的降解影响与其对Cd2+的吸附影响类似(图3)。

图3 投加量对诺氟沙星去除的影响

当投加量分别为1.0，5.0，8.0，10.0，14.0 g时，去除率最高分别约为60%，75%，90%，94%，96%。投加8 g固定化无菌小球的去除率仅30%左右，说明固定化载体海藻酸钠等对NOR有吸附去除的效果，但生物降解是NOR去除的主要方式。投加量大于8 g时，投加量增加NOR去除率无显著变化，这可能跟葡萄糖的含量和诺氟沙星的浓度有关。有研究表明，葡萄糖作为容易微生物直接利用的低分子有机物，在共代谢过程中对目标污染物的降解有一定程度的促进作用[10]。在模拟废水中葡萄糖既作为营养物质，也作为共代谢有机物参与诺氟沙星的降解，共代谢作用可能随葡萄糖浓度降低而减弱；而模拟废水中诺氟沙星降解到较低浓度水平后，微生物可能无法进行进一步降解。

2.3 不同葡萄糖浓度对NOR和Cd2+去除效果的影响

图4是不同葡萄糖浓度对模拟废水中Cd2+去除效果影响的实验结果。

图4 葡萄糖浓度对镉离子去除的影响

由图4可知，葡萄糖含量为0 g/L时，镉离子去除率在45%左右；葡萄糖含量为3，5，10 g/L时，Cd2+去除率最高分别约67%，75%，82%。葡萄糖浓度对Cd2+去除率的影响主要体现在黄孢菌的生长上。葡萄糖浓度增加，黄孢菌菌球上菌丝生长，比表面积增大，有利于对镉离子的吸附。

葡萄糖浓度对诺氟沙星的降解效果影响较明显(图5)。不添加葡萄糖的模拟废水中，NOR去除率很低，添加了葡萄糖的模拟废水中NOR去除率随浓度增加逐渐增大。葡萄糖浓度为3，5，10 g/L时，诺氟沙星去除率最高分别约36%，60%，91%。葡萄糖浓度增加，黄孢菌生长繁殖良好，可稳定分泌木质素降解酶以保证NOR的降解；另一方面可能是由于葡萄糖共存条件下的共代谢作用促进了NOR的降解。

图5 葡萄糖浓度对诺氟沙星去除的影响

2.4 不同Mn2+浓度对诺氟沙星和Cd2+去除效果的影响

图6是不同锰离子浓度下对模拟废水中Cd2+去除效果影响的实验结果，结果显示Mn2+对Cd2+的去除效果无明显影响。

图6 二价锰离子对镉离子去除的影响

图7为不同Mn2+浓度对NOR去除率的影响，锰离子浓度为0，0.01，0.1，0.5 mmol/L时NOR降解率分别约为39%，78%，90%，60%。NOR去除率随Mn2+浓度增加而增大，增大到一定浓度后继续增加时去除率反而下降。这可能是因为Mn2+是锰过氧化物酶的活性元素，能调节锰过氧化物酶的合成，合适的锰离子浓度能促进NOR的降解[11-12]，但较高浓度的锰离子可能对黄孢原毛平革菌有毒性从而抑制NOR的降解。

图7 二价锰离子对诺氟沙星去除的影响

3 结论

本实验以白腐真菌模式菌种黄孢原毛平革菌为研究对象，在镉和诺氟沙星复合污染培养下，研究了黄孢原毛平革菌对模拟复合污染废水的耐受性，考察了海藻酸钠固定化黄孢原毛平革菌对模拟废水的处理的影响因素，实验主要结论如下：

(1)诺氟沙星和镉离子复合污染对黄孢原毛平革菌的生长有一定抑制作用，黄孢原毛平革菌对较高浓度的NOR和Cd2+敏感性稍强，生长速度慢于添加NOR和Cd2+浓度较低的培养基，在培养时间内黄孢原毛平革菌菌落也长满了整个平板。

(2)海藻酸钠固定化黄孢原毛平革菌处理模拟复合污染废水影响因素实验中：最佳投加量为 8 g/L，最佳葡萄糖初始浓度为10 g/L，最佳Mn2+初始浓度为0.1 mmol/L；Cd2+去除率最高为82.11%，NOR去除率最高为90.42%。

实验结果说明海藻酸钠固定化黄孢原毛平革菌对于重金属和有机物复合污染类型有一定的修复潜力，具有研究意义和应用前景。