新城疫病毒Anhinga株HN基因的克隆与生物信息学分析

何金娇，毛雪飞，仇书兴，李 瑞，李 鹏，董春秀，刘洋洋，栾 淼，吴云舟*

(1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.新乡学院生命科学与基础医学学院，河南新乡 453003)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，属副黏病毒科[1]。根据不同病毒株对鸡致病力的强弱，可将NDV分为缓发型(弱毒株)、中发型(中等毒力株)和速发型(强毒株)，其中速发型的毒株能够在禽类之间产生较高的病死率，主要表现症状为神经紊乱、发热、呼吸不通畅等[2]。

新城疫病毒基因组主要编码6种蛋白，其中HN蛋白是位于病毒囊膜表面呈突起状的跨膜糖蛋白，是一种多功能纤突Ⅱ型糖蛋白，具有血凝素活性(hemagglutinin activity，HA)，能够使NDV识别宿主细胞唾液酸受体并与受体细胞相融合；还具有神经氨酸酶活性(neuraminidase activity，NA)，可以水解唾液酸受体，防止病毒与受体细胞凝聚簇集，便于子代NDV进入宿主细胞内，提高NDV活性[3-4]。此外，通过NDV与宿主细胞膜融合机制的研究发现，NDV HN蛋白在具有HA和NA活性的同时，还具有与同样位于NDV囊膜的融合蛋白(F)相互作用的活性，一起介导病毒进入宿主细胞，用HN蛋白的HA活性使NDV识别宿主细胞表面的神经氨酸受体引发受体细胞感染[5-6]。HN蛋白对NDV的毒力、复制能力和组织嗜性上有着重要的影响[7-8]。

暴露于病毒表面的HN蛋白是病毒识别并入侵宿主细胞的关键性受体，也是疫苗开发的重点研究对象。已有研究发现神经氨酸酶同样存在于恶性肿瘤细胞表面，HN蛋白所拥有的神经氨酸酶活性能够使NDV感染肿瘤细胞，诱导宿主激活自身免疫系统从而达到治疗癌症的效果[9-10]。NDV还能够在缺氧肿瘤组织中破坏对某些类型的化学疗法具有抗性的癌细胞以及具有凋亡抗性的肿瘤细胞，是一种具有潜力的治疗癌症的佐剂[11-13]。用生物信息学方法对新城疫病毒Anh株HN蛋白的结构与功能进行分析，可以对与肿瘤细胞表面神经氨酸酶位点特异性结合的新城疫病毒HN蛋白类疫苗研究提供参考，为深入探究不同病毒株来源的HN蛋白与NDV感染和抗肿瘤活性之间的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 新城疫病毒中等毒力Anh株由东北农业大学生命科学与生物技术研究中心实验室惠赠。

1.1.2 主要试剂 Trizol reagent，美国Invitrogen公司产品；SMART MMLV Reverse Transcritptase、pMD-18T载体、TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer、dNTP溶液、限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ，大连宝生物工程有限公司产品；质粒小量提取试剂盒和胶回收纯化试剂盒，TAKARA公司和北京索莱宝科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 Veriti梯度PCR仪，美国ABI公司产品；核酸电泳系统和凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司产品；低温高速离心机，美国Theremo Fisher公司产品。

1.1.4 引物 根据已知的新城疫病毒Anh株HN基因序列(登录号：AY562986.1)，应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物，上游引物序列为：F:5′-CTCGAGATGGATCATGTAGTCAGCAG-3′(下划线序列为XhoⅠ酶切位点)；下游引物序列为：R:5′-AAGCTTTTAAACCCTGTCTTCCTTGA-3′(下划线序列为HindⅢ酶切位点)，引物序列由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 新城疫病毒Anh毒株HN基因的扩增 采用TRIzol法提取病毒总RNA，按试剂盒说明书操作，将其反转录成cDNA。以反转录的cDNA为模板，利用上游引物和下游引物进行RT-PCR扩增，预期扩增目的片段约为1 800 bp。反应体系10 μL：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，10×PCR buffer 1 μL，ddH2O补至10 μL。反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；最后72℃延伸5 min。反应完成后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，然后用胶回收试剂盒将目标条带切割纯化。

1.2.2 重组质粒的构建、鉴定及测序 胶回收试剂盒纯化PCR产物后，与pMD18-T载体连接，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，随后将转化细胞接种至含Amp的LB固体培养基中37℃过夜培养，次日挑选LB固体培养基中单个白色菌落接种至10 mL加有Amp的LB液体培养基中，置于37℃摇床上振荡培养过夜，进行菌液PCR鉴定，质粒抽提后进行双酶切鉴定。将上述鉴定为阳性的质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.3 Anh株HN蛋白的序列获取 从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载HN基因核苷酸序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列。

1.2.4 Anh株HN蛋白基本性质的预测 用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)预测HN蛋白的基本理化性质；用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)预测HN蛋白的亲疏水性；用TMHMM Server.v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)数据库预测HN蛋白的跨膜结构；用SignaIP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)预测HN蛋白的信号肽；用NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测HN蛋白的糖基化修饰位点；用Net Phos 3.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测HN蛋白的磷酸化位点；用DNAstar及IEDB(http://www.iedb.org/)预测HN蛋白的细胞表位抗原位点。以上预测所用序列均为生物公司测序的结果。

1.2.5 空间结构及结构域分析 用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)预测HN蛋白的二级结构；使用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)预测HN蛋白的三级结构；通过SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)构建HN蛋白的四级结构模型，在数据库CDD中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)获取HN蛋白的结构域。以上预测所用序列皆是生物公司测序的结果。

2 结果

2.1 Anh毒株HN基因的RT-PCR扩增

以提取的毒株总RNA反转录的cDNA为模板，采用上、下游引物对Anh毒株HN基因进行PCR扩增，在1 800 bp左右出现特异性条带，与预期条带大小相符(图1)。

M.DNA标准DL 5 000；1.Anh株HN基因PCR扩增产物M.DNA Marker DL 5 000；1.PCR products of HN gene of Anh strain图1 Anh株HN基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of HN gene of Anh strain

2.2 重组质粒的鉴定及测序

将胶回收后的PCR片段，克隆至T载体上，构建重组质粒。分别用相应的上游引物和下游引物对重组质粒进行PCR鉴定，鉴定结果与预期条带大小相符(图2)。然后，将PCR鉴定为阳性的重组质粒分别经XhoⅠ和HindⅢ双酶切，酶切结果与预期相符(图3)。将上述鉴定正确的阳性重组质粒送到上海英骏生物技术有限公司测序，并通过DNAman软件比对分析后，与NCBI上Anh株HN基因核苷酸序列的同源性为99.77%。

M.DNA标准DL 5 000；1.重组质粒；2.重组质粒的PCR鉴定M.DNA Marker DL 5 000；1.Recombinant plasmid；2.PCR identification of recombinant plasmid图2 重组质粒的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid

M.DNA标准DL 5 000；1.重组质粒经HindⅢ和XhoⅠ双酶切M.DNA Marker DL 5 000；1.Recombinant plasmid digested by HindⅢ and XhoⅠ图3 重组质粒的双酶切鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.3 HN蛋白的结构与功能预测

2.3.1HN基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列 Anh株HN基因序列号为：EF065682.1；GI：118181197。氨基酸序列登录号为：ABK63994.1。

2.3.2 HN蛋白理化性质分析 用ExPASy ProtParam对新城疫病毒Anh株HN蛋白进行理化性质预测分析。结果显示，其HN蛋白的分子式为C2786H4380N760O851S24；由571个氨基酸组成，其中Ser较多，占10.2%；Trp占0.5%含量最少；相对分子质量为62 907.45 u；理论PI=7.19；若HN蛋白中Cys残基均形成胱氨酸时，在280nm处1 g/L溶液中的消光系数为0.937，若HN蛋白中所有Cys残基均以残基形式存在，在280nm处1 g/L溶液中的消光系数为0.925；脂肪系数预测值为86.15；不稳定系数为32.38，小于阈值，说明HN蛋白稳定性较高。

2.3.3 HN蛋白亲疏水性分析 用ExPASy ProtScale在线软件Hphob./Kyte &Doolittle模式对HN蛋白的氨基酸序列进行疏水和亲水性分析。预测结果显示HN蛋白最高疏水性分值点是41位的Val，分值为2.822，最高亲水性分值点是15位的Arg，分值为-3.067。序列中所有氨基酸得分平均值为-0.104 16，预测为亲水性蛋白(图4)。

图4 Anh株HN蛋白疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity analysis of HN protein of Anh strain

2.3.4 HN蛋白的跨膜结构域和信号肽

2.3.4.1 HN蛋白的跨膜结构域分析 用TMHMM server 2.0软件HN蛋白的跨膜区预测，结果显示(图5A)，HN蛋白的跨膜螺旋数(Number of predicted TMHs)为1，跨膜螺旋区氨基酸数(Exp number of AAs in TMHs)为22.73903，大于18，很可能为跨膜蛋白；且HN蛋白的N端在病毒膜内的概率为99.886%，HN蛋白aa 1-22位于病毒膜内，aa 23-45构成一个跨膜螺旋结构区,而HN蛋白aa 46-571位于病毒表面。结果表明，HN蛋白属于一次跨膜结构蛋白，可初步推测，位于病毒膜表面的氨基酸序列可能与其毒性相关。

2.3.4.2 HN蛋白的信号肽预测 用SignaIP 5.0在线软件对Anh株HN蛋白信号肽的有无进行预测。预测结果显示，Anh株HN蛋白不存在信号肽(图5B)。

2.3.5 HN蛋白翻译后修饰位点预测分析

2.3.5.1 HN蛋白的糖基化修饰分析 Asn在Asn-Xaa-Ser/Thr片段中会发生糖基化，其中Xaa是不包括脯氨酸的任何氨基酸，通过NetNGlyc 1.0 Server在线软件对HN蛋白的N-糖基化位点进行预测。结果显示，Anh毒株HN蛋白有4个Asn是潜在N-糖基化位点，分别在aa 119、341、433、481(图6A)。

2.3.5.2 HN蛋白磷酸化位点的分析 利用Net Phos 3.1 server在线预测HN蛋白的磷酸化位点。结果显示，Anh毒株HN蛋白具有较多磷酸化位点且未过阈值的位点磷酸化倾向也很高，说明该蛋白整体磷酸化倾向较高(图6B)，而蛋白质的磷酸化和去磷酸化几乎参与所有的生命活动。因此根据其磷酸化程度可推测HN蛋白与Anh株病毒感染机制高度相关，在Anh株病毒感染宿主时发挥重要作用。

A.HN蛋白的跨膜结构域分析；B.HN蛋白的信号肽分析；SP (Sec/SPI)代表出现信号肽类型的概率,CS代表切割位点出现的概率,OTHER代表不包含任何信号肽的概率A.Transmembrane domain analysis of HN protein;B.Signal peptide analysis of HN protein；SP (Sec/SPI)represents the probability of occurrence of signal type,CS represents the probability of occurrence of cleavage site,and other represents the probability of no signal peptide图5 HN蛋白的跨膜结构域和信号肽分析Fig.5 Transmembrane domain and signal peptide analysis of HN protein

A.HN蛋白的糖基化修饰预测；B.HN蛋白的磷酸化位点预测A.Prediction of glycosylation modification of HN protein;B.Prediction of phosphorylation sites of HN protein图6 HN蛋白的糖基化和磷酸化位点预测Fig.6 Prediction of glycosylation and phosphorylation sites of HN protein

2.3.6 HN蛋白的B细胞表位预测分析 使用DNAstar Protean程序预测HN蛋白的抗原表位时选择了亲水性、表面可及性及柔韧性三种预测方法结合的方式来预测抗原表位，由于氨基酸的性质决定了亲水性残基大概率位于蛋白表面，易于参与形成抗原表位；当氨基酸活性越强时，其柔韧性得分越高，柔韧性得分高的位点说明其参与生命活动的可能性较高，可能参加蛋白抗原与抗体结合，是形成B细胞抗原表位的优良位点。对其各项指标进行综合分析预测，可推测主要的B细胞抗原表位极大概率可能出现在aa 8-19、68-83、127-137、142-149、166-174、227-235、256-266、281-293、307-312、318-333、339-364、449-457、492-499、509-523(图7)。

图7 HN蛋白的B细胞抗原表位的预测Fig.7 Prediction of B cell epitopes of HN protein

2.3.7 HN蛋白的空间结构

2.3.7.1 HN蛋白的二级结构 通过SOPMA对HN蛋白的二级结构进行预测分析。结果显示，Anh株HN蛋白二级结构中无规则卷曲占比最多，为47.46%，β转角所占比例最少，为3.85%，此外α螺旋为25.04%，延伸链为23.64%。二级结构各组分中α螺旋含量并不少，但根据2.3.4.1结果可知其主要存在于病毒膜内侧与跨膜部位且较为集中，而β转角含量则较低，病毒膜外主要是由无规则卷曲及延伸链组成(图8)。由于化学键键能较低的无规则卷曲含量较多，因此推测HN蛋白位于病毒膜外侧的空间结构易于发生改变，是一种多功能蛋白。

图8 HN蛋白的二级结构分析Fig.8 Secondary structure analysis of HN protein

2.3.7.2 HN蛋白的三维结构 图9A为HN蛋白三级结构3D平面图。预测结果与二级结构预测结果基本吻合(图8)，该蛋白的三级结构主要是α螺旋、延伸链和无规则卷曲组成。

2.3.7.3 HN蛋白的结构域分析 通过CDD数据库获取HN蛋白的结构域。结构域ID：10450460，属于神经氨酸酶CL21531超家族。活性位点在氨基酸序列中是由以下位点aa 174-198-401-416-498-526-547组成的，其序列为R-D-E-R-R-Y-E；受体结合位点在氨基酸序列中是由以下位点174-258-299-317-363-364-401-416-418-466-498-526组成的，其序列为R-E-Y-Y-R-F-E-R-S-I-R-Y(图9B)。

A.HN蛋白的三级结构预测；B.HN蛋白的结构域预测A.Prediction of tertiary structure of HN protein；B.Prediction of domain of HN protein图9 HN蛋白的三级结构和结构域预测Fig.9 Prediction of tertiary structure and domain of HN protein

2.3.8 HN蛋白的氨基酸序列变异分析 在NCBI中查找到的新城疫病毒HN蛋白基因序列号：NC-039223.1，GI：37627205。HN蛋白序列号：YP-009513198.1，GI：1464315645。将测序结果与NCBI上HN蛋白的氨基酸序列进行比对分析。结果显示，二者具有较高的同源性，为91.07%。且在aa 25-45之间的跨膜区序列变异程度相对于膜内和膜外的变异程度整体较高，可推测跨膜区的变异可能与其毒力的大小相关。且其在膜外的变异位点多是组成无规则卷曲的氨基酸，而无规则卷曲是蛋白质空间结构的变化过程中起重要作用的部位，与蛋白质的功能息息相关(图10)。

图10 HN蛋白的氨基酸序列分析Fig.10 The analysis of amino acid sequence of HN protein

3 讨论

通过生物信息学分析中等毒力Anh株HN蛋白的结构和功能，可知HN蛋白为无信号肽的跨膜蛋白，且HN蛋白中疏水序列主要位于蛋白的N端胞质区和跨膜区。HN蛋白的糖基化修饰和磷酸化修饰对HN蛋白的总体活性具有一定影响，根据预测结果可知HN蛋白具有较高的磷酸化倾向，说明其在病毒入侵宿主细胞时较为活跃，参与多项生命活动。此外，不同位点的修饰会影响病毒感染宿主细胞，这两种化学修饰也参与受体细胞与病毒的融合，影响病毒蛋白的分泌合成，而且处于病毒胞膜糖蛋白上的糖基化或磷酸化可以使病毒躲避宿主的免疫应答识别，因此，蛋白的糖基化与磷酸化修饰与病毒进入宿主细胞以及病毒的复制能力大小都有着紧密的联系[14]。

研究结果表明，HN蛋白属于神经氨酸酶超家族，具备神经氨酸酶与血凝素活性，因此HN蛋白可识别宿主表面的唾液酸受体使NDV与受体细胞融合，也可使唾液酸受体水解，防止病毒与受体细胞凝聚簇集，有助于凝集的受体细胞上的病毒释放，加快病毒对宿主的感染。已有研究结果表明与F蛋白的融合会影响NDV的毒力，而HN蛋白中aa 124-152对与F蛋白相互作用具有重要意义[15]。在氨基酸序列分析中，aa 124-152中第135位相较于与NCBI所给序列发生了变异，由Thr变为了Val。我们可以推测，HN蛋白毒力的变化，一是由于与F蛋白结合位点发生了突变，影响其与宿主细胞膜融合的功能；二是由于HN蛋白的跨膜结构和位于膜外的无规则卷曲部位发生了变异，导致其与宿主细胞的识别发生了影响，两者共同作用导致其毒力发生改变。

通过分析HN蛋白发现其参与多种病毒的生命活动，对促进NDV与受体的融合，识别受体位点以及与其他蛋白的相互作用具有重要意义。本研究通过生物信息学方法分别对Anh HN蛋白的结构和功能进行分析，为进一步探究HN蛋白毒株来源不同与NDV感染活性及其抗肿瘤活性之间的关系奠定了基础。