TGF-β1在布鲁氏菌致炎过程中的作用及其与NLRP3炎症小体的相关性研究

陶婷婷，赵天艺，李 佳，朱德馨，邱润辉，王梓行，孙志华,2,3*，张 辉,2,3*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.新疆生产建设兵团动物疾病防控重点实验室，新疆石河子 832000；3.动物健康养殖国家国际联合研究中心，新疆石河子 832000)

布鲁氏菌(Brucella)通过脂多糖(LPS)等病原相关分子模式被宿主细胞表达的模式识别受体(PRRs)识别，进而启动下游信号通路，引起炎症反应[1-2]。NOD样受体家族(NLR)作为PRRs中的一类，是构成NLRP3炎症小体的主要成分，NLRP3炎症小体能够被多种病原微生物所激活[3-4]。NLRP3 炎症小体在布鲁氏菌感染小鼠过程中被激活而引起的炎症反应有利于机体的抗感染免疫作用[5]。转化生长因子β (TGF-β)超蛋白家族在免疫炎症反应方面主要抑制 T、B 淋巴细胞的增殖分化，降低NK细胞的杀伤作用和补体系统的溶菌作用，调节巨噬细胞的吞噬能力和对抗病原微生物反应能力[6-7]。但是有关转化生长因子β1 (TGF-β1)在调节炎症反应中的促进或抑制作用机理尚不够清楚。本文通过比较布鲁氏菌感染宿主前后 TGF-β1的释放量和在其 mRNA 水平和蛋白水平的表达，初步探讨 TGF-β1 在布鲁氏菌感染中的扮演角色，旨在阐述 TGF-β1 在布鲁氏菌感染引发的炎症尤其在关节炎中的作用机制，进一步研究分析布鲁氏菌在体内和体外感染宿主过程中通过激活 NLRP3 炎症小体诱发的炎症反应与 TGF-β1 抑炎或促炎的相关性，为布鲁氏菌致炎分子机制及布鲁氏菌性关节炎的抗体治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、菌种和实验动物 小鼠RAW264.7 巨噬细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；Brucellaabortus2308株由新疆石河子大学动物科技学院动物疾病防控兵团重点实验室保存；普通级昆明小鼠购自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐疾控中心。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清，美国Gibco公司产品；Recombinant Hunman TGF-β1(100-2C)，Peprotech公司产品；TRIzol，美国Invitrogen公司产品；RNase-free-water、逆转录试剂盒，北京康为世纪公司产品；Rabbit Anti-TGF Beta 1 antibody (bs-0103R)，北京博奥森生物技术有限公司产品；TGF-β1抗体，abcam公司产品；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，Bioworld公司产品；NC膜，Solarbio公司产品；DAB显色液，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；小鼠转化生长因子 β1 (TGF-β1)、IL-1β、IL-18 ELISA试剂盒，美国RD公司产品；10×PBS，北京索莱宝公司产品；TRYPTONE SOYA AGAR(TSA)、TRYPTONE SOYA BTOTH(TSB)，英国 OXOID 公司产品；TGF-β1、β-actin引物，华大基因公司合成(表1)。

表1 实时荧光定量引物及序列Table 1 Sequences of primers used for real-time qPCR

1.1.3 主要仪器 恒温培养箱(HIQ-X100)，美国赛默飞世尔科技有限公司；高速冷冻离心机，美国Thermo公司；聚丙烯凝胶电泳仪(DYY-8B)，北京六一生物科技有限公司；半干式电转仪，美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 布鲁氏菌感染重组转化生长因子β1预处理的巨噬细胞RAW264.7 将RAW264.7细胞按照每孔1×106个细胞接种至6孔板内过夜培养，取0.01 mg /mL的rTGF-β1蛋白与小鼠巨噬细胞(1×106个/孔)共孵育12 h，同时设置阴性对照和空白对照。收集对数生长期的牛种布鲁氏菌2308菌株，8 000 r/min 离心2 min，用PBS清洗菌体2次～3次，通过麦氏比浊管进行比浊，按照100∶1(细菌个数∶细胞个数)的比例感染巨噬细胞RAW264.7，阴性对照加入与等体积的PBS，37℃、体积分数为5% CO2饱和湿度的环境下共培养1 h，预冷的PBS润洗RAW264.7细胞2次后，加入新鲜含100 mL/L FBS的DMEM培养液，加入50单位的庆大霉素于培养基中继续孵育45 min，以杀死胞外布鲁氏菌。预冷的PBS润洗RAW264.7细胞2次～3次后，加入新鲜的含血清的DMEM培养液继续培养，分别在不同的时间段(0、4、12、24 h)收集细胞上清和沉淀备用。

1.2.2 构建布鲁氏菌感染小鼠TGF-β1抗体治疗模型 收集对数生长期的布鲁氏菌，离心收集菌体，用生理盐水漂洗2遍，将菌液稀释至5×106CFU/mL，采用腹腔注射法将布鲁氏菌以5×106个剂量感染小鼠，对照组注射等体积的生理盐水。分别在感染后第1周、第2周、第3周、第4周采集小鼠外周血，收集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏于液氮和福尔马林溶液中备用。在造模后第28天采用尾根静脉注射法注射TGF-β1抗体，每只小鼠注射约500 μL浓度为1 μg/mL的TGF-β1抗体，对照组注射相同体积的PBS缓冲液。分别在注射后第1周～第4周收集小鼠外周血血清。

1.2.3 荧光定量PCR检测转录水平的变化 分别在布鲁氏菌感染RAW264.7细胞和rTGF-β1预处理的RAW264.7细胞0、4、12、24 h后弃去培养上清，用预冷的PBS缓冲液润洗3次，按照Invitrogen公司的Trizol说明书进行总RNA的提取。用超微量紫外分光光度计测定总RNA在260 nm/280 nm处吸光度(OD260/280)值以确定其纯度；取5 μL提取样品经10 mL/L甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。以提取的RNA为模板，采用康为世纪cDNA Synthesis Kit试剂盒进行cDNA的合成，以cDNA为模板，采用RT-qPCR进行相关基因表达的相对定量分析，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

1.2.4 ELISA法检测TGF-β1及炎性因子IL-1β和IL-18的释放量 在布鲁氏菌感染 RAW264.7细胞0、4、12、24 h后收集细胞上清，按照ELISA检测试剂盒说明书进行检测。小鼠感染布鲁氏菌后，在第1周～第4周采用摘除眼球法收集小鼠外周血，此外收集TGF-β1抗体治疗的后第1周～第4周小鼠外周血，按照ELISA检测试剂盒说明书步骤进行相关因子含量测定。

1.2.5 Western blot检测布鲁氏菌感染宿主细胞过程TGF-β1在蛋白水平变化情况 分别在巨噬细胞感染布鲁氏菌4、12、24、48 h后，弃去细胞培养液，PBS缓冲液清洗3次，按照6孔板每孔加入200 μL裂解液的比例，用移液枪反复吹打，使裂解液与细胞充分接触，冰上放置裂解10 min后，将裂解物收集至EP管中，13 000 r/min离心10 min，收集上清，即为蛋白样品，置-80℃冷冻保存备用。利用SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶上的蛋白条带转印至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，加入Rabbit Anti-TGF-β1 antibody作为一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG二抗室温下孵育2 h，洗膜后，在NC膜上加1 mL DAB显色液，显色3 min～5 min后，照相保存。

1.2.6 病理切片和免疫组化 分别在布鲁氏菌攻毒后第1周～第4周后分别从试验组和对照组各取3只小鼠，采用颈部脱臼法处死，迅速打开腹腔，迅速摘取小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，制作病理切片，并通过免疫组化检测TGF-β1在小鼠肝脏、肾脏和脾脏中的表达。

2 结果

2.1 布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7中TGF-β1的表达

流产布鲁氏菌2308感染小鼠巨噬细胞胞内寄生存活过程中，胞内TGF-β1 mRNA表达量在不同的感染时间点(0、4、12、24 h)与对照组 PBS相比均出现不同程度的变化，其中在细菌侵染细胞初期(0 h)TGF-β1 mRNA表达量均显著高于PBS对照组(P<0.01)，而在进入胞内后与对照组相比没有显著的变化(图1)。在感染0、4、12、24 h 后通过哺乳动物细胞蛋白抽提试剂盒步骤提取细胞总蛋白，按BCA法定量后进行SDS-PAGE凝胶检测，用半干湿转膜法检测TGF-β1在蛋白表达水平的表达(图2)，在不同的侵染时间点TGF-β1在蛋白水平上逐步呈现上升趋势，且差异显著(P<0.001)。用ELISA法检测细菌感染细胞过程中TGF-β1的分泌情况，根据标准曲线线性方程计算不同时间点TGF-β1的浓度值，结果显示，布鲁氏菌感染巨噬细胞后细胞因子TGF-β1的浓度在4、12、24 h含量均显著高于对照组(P<0.05 )，且持续升高(图3)。

图1 侵染细胞中TGF-β1基因相对表达量Fig.1 The expression of TGF-β1 gene in Brucella infected cells

图2 WB检测感染细胞中TGF-β1蛋白水平的变化Fig.2 The protein levels of TGF-β1 in Brucella infected cells detected by Western blot

图3 TGF-β1炎性因子在布鲁氏菌感染细胞中的变化趋势Fig.3 The trends of TGF-β1 in Brucella infected cell model

2.2 布鲁氏菌感染小鼠外周血血清中TGF-β1含量

建立布鲁氏菌感染小鼠模型，分别在感染1、2、3、4周后收集感染鼠外周血血清，ELISA检测结果显示，与对照组相比，感染组小鼠血清中炎性因子 TGF-β1的表达量均显著降低(P<0.05)，但在感染第2周后逐步表现为上升趋势，并且各感染组之间也存在差异(图4)。

图4 布鲁氏菌感染模型小鼠外周血中TGF-β1含量Fig.4 The levels of TGF-β1 in peripheral blood of miceafter Brucella infection

2.3 TGF-β1预孵育细胞后布鲁氏菌感染细胞中IL-1β和IL-18的分泌情况

用ELISA检测布鲁氏菌侵染rTGF-β1预孵育的巨噬细胞中炎症因子IL-1β和IL-18的分泌，与对照组相比，4 h时TGF-β1预处理组IL-18的分泌量无显著差异，其余各时间段炎症因子IL-1β和IL-18释放量显著升高(P<0.05)，表明 TGF-β1在布鲁氏菌侵染过程中诱发的炎症反应中发挥一定作用(图5)。

图5 细胞上清中炎症因子IL-1β和IL-18的含量Fig.5 The contents of IL-1β and IL-18 in cell supernatant

2.4 TGF-β1在布鲁氏菌感染小鼠脏器中的表达

小鼠感染布鲁氏菌后，主要表现为肝脏组织中出现淋巴细胞浸润，部分肝细胞核溶解、消失，细胞坏死，少数细胞发生脂肪变性；脾脏组织出现上皮样细胞结节，局部组织有淤血；肾脏肾小管上皮细胞肿胀导致肾小管内径变小，部分肾小管上皮细胞溶解，肾间质有出血和充血现象。通过免疫组化检测TGF-β1在肝脏和脾脏中的变化情况，结果显示，与对照组相比，布鲁氏菌感染组肝脏和脾脏组织着色较深，表明TGF-β1 在布鲁氏菌感染小鼠肝脏和脾脏中均出现不同程度的高表达(图6)。

图6 TGF-β1在布鲁氏菌感染鼠肝脏和脾脏中的表达(IHC)Fig.6 The expressions of TGF-β1 in spleen and liver of mice infected with Brucella

2.5 TGF-β1抗体干预后对布鲁氏菌感染鼠血清中IL-1β和IL-18的影响

布鲁氏菌感染小鼠后，分别在在感染后1周～4周收集小鼠外周血，检测血清中炎性因子IL-1β和IL-18的分泌量，结果显示，与对照组相比，感染组小鼠血清中炎性因子IL-1β和IL-18的表达量均显著升高 (P<0.05)，且各侵染组之间也存在差异(图7 A,B)。建模后28天，尾根静脉注射TGF-β1抗体，探究TGF-β1在布鲁氏菌诱发的炎症的影响，在注射TGF-β1后第1天、第15天、第30天收集小鼠外周血，检测血清中炎性因子IL-1β和IL-18的释放量。结果显示，且与对照组相比，感染组注射TGF-β1抗体后IL-1β和IL-18的释放量显著下降(P<0.05)，且在布鲁氏菌感染小鼠TGF-β1抗体干预组呈时间依赖效应(图7 C,D)。初步表明注射TGF-β1抗体可以引起NLRP3炎症小体相关因子IL-1β和IL-18的释放量降低，缓解了炎症反应。

3 讨论

布鲁氏菌病是一种变态反应性人兽共患传染病，给人类和畜牧业带来巨大的危害，严重影响着人类健康和畜牧业的快速发展[8-9]。布鲁氏菌感染哺乳动物期间通过改变PAMP的关键分子来逃避宿主的天然免疫应答并在宿主免疫系统中建立一个利于自身存活或复制的微环境。布鲁氏菌含有非典型的LPS结构，侵染宿主后通过与细胞表面受体结合引起微弱的炎症反应或延迟反应，如通过与NLR结合导致NLRP3炎症小体的活化而引起的炎症反应有利于机体的早期抗感染免疫作用[10]。

TGF-β1是一种调控细胞生长的多肽，主要由血小板、单核巨噬细胞、淋巴细胞、软骨细胞和结缔组织细胞分泌，可以调节机体内诸多细胞，参与细胞的复制、分化以及血管和骨骼的形成，与组织增生修复密切关联[11-12]。TGF-β1的在免疫反应中主要表现为阻碍T、B淋巴细胞的增殖、对NK细胞的活性和T细胞的反应性进行下调，调节巨噬细胞吞噬能力。布鲁氏菌感染除了导致典型的波浪热等症状外可引起关节疼痛、肿大或关节炎等非典型症状，这种布鲁氏菌性关节炎类似于风湿性关节炎[13-14]。在小鼠前交叉韧带切断(ACLT)骨关节炎模型中，改变机械负荷可引起软骨下骨中转化生长因子β1(TGF-β1)被激活[15-16]。与野生鼠相比，TGF-β1受体敲除鼠减少了ACLT后骨关节炎的发生，表明TGF-β1在关节炎的诱发及治疗中有重要作用。

A、B.布鲁氏菌感染前后IL-1β和IL-18的释放量;C、D.TGF-β1 抗体干预治疗后IL-1β和IL-18的释放量A，B.IL-1β and IL-18 releases before and after Brucella infection;C,D.IL-1β and IL-18 releases after TGF-β1 antibody intervention图7 小鼠血清中炎症因子IL-1β和IL-18的含量Fig.7 The contents of IL-1β and IL-18 in mouse sera

布鲁氏菌感染巨噬细胞后TGF-β1在细胞上清中的含量显著增加，并随着时间的延长呈上升趋势，同时TGF-β1在蛋白水平和mRNA水平均显著升高。布鲁氏菌感染小鼠的外周血血清中TGF-β1的释放量也出现不同程度的升高，并在小鼠脏器中也有所表达。表明TGF-β1参与了布鲁氏菌致炎机制的调控。本文研究了布鲁氏菌在体内和体外感染宿主过程中激活NLRP3炎症小体诱发的炎症反应与TGF-β1抑炎或促炎的相关性，证实外源性TGF-β1可以导致炎性因子IL-1β和IL-18的增加，能够促进炎症反应的发生。综上可知，布鲁氏菌感染可以激活NLRP3炎症小体，引发炎症反应，布鲁氏菌感染可以诱导TGF-β1的高表达，而高浓度的TGF-β1进一步促进了NLRP3炎症小体激活引发的炎症反应，为布鲁氏菌致炎机制的深入研究奠定基础。