德国牧羊犬复孔绦虫种类鉴定和遗传进化分析

简永利，于三科，宋军科，王会宝，高永安，王清艳，李培德，涂宜强

(1.温州科技职业学院动物科学学院，浙江温州 325006；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；3.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046)

犬复孔绦虫(Dipylidiumcaninum)是一种寄生在犬、猫、狐等动物小肠中的常见寄生虫，需要节肢动物毛虱或蚤作为中间宿主完成其生活史。据国内外流行病学调查报道，犬和猫的感染率为6.25%～40.8%[1,2]。轻度感染时，犬、猫一般无临床症状，幼犬感染可引起消化不良、腹痛、腹泻、肛门瘙痒等临床症状，严重者会出现死亡[3]。人偶尔因误食含有似囊尾蚴的蚤而感染，据报道至少23个国家或地区有散在发生的病例[4]。犬复孔绦虫病呈世界性分布，虽然人感染的风险较低，但婴幼儿和1岁～5岁的儿童感染的病例较多，主要与其玩娱习惯和感染的犬、猫接触密切有关[4-5]。我国北京、四川、河北、福建、山东、安徽、山西、河南、湖南等地有病例报告。目前为止，成年人感染比较少见，国内仅报道有3例，而儿童特别是5岁以内的儿童感染较多，最小患儿仅33日龄，感染严重的儿童可见食欲不振、消化不良、腹痛、肛门瘙痒、消化障碍等临床症状[6-8]。因此，正确鉴定复孔绦虫的种类，对预防和控制犬复孔绦虫病及人畜共患风险评估具有重要意义。

目前，对犬复孔绦虫的鉴定主要基于形态学方法，主要通过检查粪便中是否含有米粒样的孕卵节片或包含数个虫卵的卵囊袋[9]。但复孔绦虫形态相似，临床中仅依靠传统的形态学方法也难以对其进行准确鉴定。因此，迫切需要一种更为有效、可靠的方法用于犬复孔绦虫病的临床诊断。

研究表明，分子标记技术可有效地对绦虫、吸虫、线虫进行分类鉴定[10-12]。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)作为细胞核外的独立遗传物质，已广泛作为寄生虫分类鉴定、群体遗传和系统进化研究的理想分子标记。目前用于绦虫分类鉴定的基因包括细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，cox1)基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶Ⅰ亚基(nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase Ⅰ subunit，nad1)基因、内转录间隔区(internal transcribed spacer region，ITS)等[13-15]。本研究以温州某品种犬饲养场死亡的3只犬体内分离的绦虫为研究对象，通过传统的形态学方法并结合线粒体cox1和nad1基因的遗传进化分析进行研究，以期为复孔绦虫病的诊断、流行病学调查和防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体 本试验虫体3条(分别名为WZ1、WZ2、WZ3)，采自温州某品种犬场急性死亡的3只德国牧羊犬。剖检发现小肠中有大量绦虫并阻塞肠道，小心取下虫体以确保虫体完整性，处理干净后置于750 mL/L乙醇中，保存备用。

1.1.2 主要试剂 乙醇、树胶、DNA提取试剂，天根生化科技(北京)有限公司产品；TaqDNA聚合酶体系、琼脂糖、DNA Marker DL 2 000，宝生生物工程(大连)有限公司产品；10 g/L孔雀绿染液，上海铭博生物科技有限公司产品；凝胶电泳试剂，生工生物工程(上海)股份有限公司产品。

1.1.3 引物 本试验所用引物参照Bowles等(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成[17]。

表1 犬复孔绦虫cox1和 nad1基因部分序列扩增引物Table 1 Primers for amplication of partial cox1 and nad1 gene sequences of D.caninum

1.1.4 仪器设备 PCR扩增仪，博日科技有限公司产品；DYY-7C稳压稳流电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；水平电泳槽，SW-CJ-1F洁净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品；HH-3A数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；Motic成像显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；离心机、移液器，Eppendorf公司产品；自动凝胶成像分析系统，北京赛智创业科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 虫体形态学鉴定 将复孔绦虫完整虫体从750 mL/L乙醇中取出，用灭菌蒸馏水清洗3次，依次从头节向后分别剪成2 cm左右的小段，置于乳酸透明液透明3 h；虫体的染色根据文献[9,16]寄生虫玻片制备方法，用孔雀绿染液对采集的绦虫进行标本制作。最后将风干1周的标本片置于显微镜下观察并采集图像。此外，采集的新鲜虫体取下孕卵节片并刺戳多个针孔，在生理盐水中洗涤节片，将洗涤的生理盐水3 000 r/min离心后，取收集的虫卵于10×40倍镜下观察，并结合虫体形态，做初步鉴定。

1.2.2 虫体基因组DNA的提取 将保存的3条绦虫虫体用生理盐水洗涤3次，剪取1 cm左右的虫体片段放置于1.5 mL离心管中，加入蛋白酶K，将其置于56℃水浴锅中消化过夜，次日按DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取的DNA样品置-20℃冰箱，备用。

1.2.3cox1基因和nad1基因的PCR扩增、电泳和测序 PCR反应体系为25 μL，包括蒸馏水11 μL、1×TaqMix液12.5 μL、引物各0.5 μL和模板DNA 1 μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共30个循环；再72℃延伸5 min。取5 μL的PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统摄像并记录结果。阳性PCR产物直接送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4 序列分析 用ClustalX1.83软件对3条虫体样品的cox1和nad1序列进行比对，同时从GenBank中检索现有复孔绦虫cox1和nad1序列(登录号为AB732959和MG587892)进行相似性比对和分析。以日本血吸虫(Schistosomajaponicum)为外群，将本研究中3个复孔绦虫cox1和nad1序列与GenBank上收录的其他绦虫线粒体基因序列，用Mega软件中的Neighbor-Joining(NJ)法构建遗传进化树(Boot-Strap值为1000)。

2 结果

2.1 形态学鉴定

新鲜虫体为乳白色或淡红色，头节小，固定后为白色，约由200个节片组成，长约为15 cm～20 cm，宽约3 mm，寄生于德牧犬肠道内。染色后虫体内部结构清晰可见(图1)。每一成熟节片内含两组生殖器官，睾丸100个～200个，生殖孔开口于虫体两侧中央靠后的位置，形似瓜籽，故称为瓜籽绦虫。卵巢葡萄状，位于生殖孔附近；孕卵节片分化为大量的储卵囊，每个储卵囊内大约含有约10个以上的虫卵。

2.2 PCR扩增结果

3条绦虫样品中均成功扩增出约450 bp和500 bp的基因片段，与预期的目的片段大小相符，且未出现非特异性条带，空白对照为阴性(图2)。阳性样品测序结果显示，3条绦虫的pcox1和pnad1核苷酸序列分别为445 bp和535 bp。通过核苷酸序列比较，3个样品测序结果完全一致。碱基分析表明，pcox1和pnad1基因A、T含量分别为69.44% 和69.72%，与D.caninum犬基因型(AB732959)序列比对，分别存在4个碱基突变，相似性为99.08%和99.05%，而与D.caninum猫基因型(MG587892)序列相比，分别有41个、73个碱基发生改变，同源性仅为90.57%和85.80%。

2.3 pcox1和pnad1种系发育分析

应用MEGA软件，将PCR扩增所得的目的序列与GenBank 上收录的犬复孔绦虫(犬)(D.caninum(dog))、犬复孔绦虫(猫)(D.caninum(cat))、日本海阔裂头绦虫(Diphyllobothriumnihonkaiense)、刺猬绦虫(Spirometraerinaceieuropaei)、缩小膜壳绦虫(Hymenolepisdiminuta)、大裸头绦虫(Anoplocephalamagna)、猪带绦虫(Taeniasolium)、大复殖孔绦虫(Diplogonoporusgrandis)的线粒体基因序列，并以日本血吸虫作为外群进行种群遗传进化分析。

a.储卵囊；b.卵巢；c.生殖孔；d.虫卵a.Egg packets；b.Oariy；c.Genital pore；d.Egg图1 成熟节片、孕卵节片(孔雀绿染色，40倍)和卵囊袋Fig.1 Mature proglottids,gravid proglottids(Malachite green staining,40×)and egg packets

M.DNA标准DL 2 000；1.阴性对照；2～4.德国牧羊犬3个复孔绦虫虫体样品M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2-4.Three samples of D.caninum from German shepherd dogs图2 犬复孔绦虫pcox1(左)和pnad1(右)基因 PCR扩增产物结果Fig.2 PCR-amplication results of the partial genes of pcox1(left)and pnad1(right)of D.caninum

基于pcox1和pnad1基因序列构建的种群进化发育树表明，本研究中的3个虫体基因序列位于同一分支，与犬源D.caninum(AB732959)亲缘关系最近，形成姐妹支，而与猫源D.caninum(MG587892)亲缘关系次之。最终，3个分离虫体与犬源D.caninum(AB732959)和猫源D.caninum(MG587892)合成一大支。将其与其他种属绦虫比较，犬复孔绦虫与A.magna、T.solium、H.diminuta等圆叶目绦虫分属一支，与D.nihonkaiense、S.erinaceieuropaei、D.grandis等假叶目绦虫距离更远，得到很好的鉴别(图3)。

图3 基于pcox1和pnad1基因序列构建进化树Fig.3 Phylogenetic tree reconstructed using the pcox1 and pnad1 gene sequences

3 讨论

复孔绦虫为双壳科复孔属绦虫，有数十种，其中以犬复孔绦虫最为常见。犬复孔绦虫的诊断主要依靠虫体形态结构(头节、顶突、成节形状和内部生殖器官结构、孕节卵袋等)、卵袋(形状，包含虫卵数量)和虫卵(大小、形状、结构)特征为主要鉴定依据。本试验采用10 g/L的孔雀绿对犬复孔绦虫进行染色，虫体染色结构与LIDIA、邢维媚描述的虫体形态基本一致[4,9]，生殖孔开口于虫体两侧中央靠后的位置，卵巢呈葡萄状，位于生殖孔附近；孕卵节片含有大量的储卵囊，每个储卵囊内大约含有10个以上个虫卵。犬复孔绦虫卵壳薄，呈透明，内含有六钩蚴，与其它带绦虫卵相近[7]，临床上出现过误诊漏诊报道，因此仅通过形态学特征很难对虫体间有差异的虫种种属进行准确地鉴定。

分子生物学技术可有效、精确地区分生物种群的遗传进化程度。在病原的分子分类、遗传变异和种群结构研究中，线粒体DNA作为一种重要的、有效的分子标记，已广泛应用于多种人兽共患寄生虫的种间、种内鉴定和种系发育分析研究[5,18]。其中，cox1和nad1基因具有种特异性和种内高保守性，因此常作为分子标记应用于绦虫的分类鉴定。为了对采集的绦虫进行种类鉴定以及遗传进化分析，本研究的3个样本中均成功扩增出pcox1和pnad1的目的基因片段，且测序结果也完全一致，表明这2个基因片段都比较保守，提示本试验采集的3个虫体同属一个种。进一步对序列进行比对分析，pcox1和pnad1与犬复孔绦虫犬基因型的同源性为99.08%和99.05%，而与犬复孔绦虫猫基因型相似性仅为90.57%和85.80%，表明本试验3个虫体与犬复孔绦虫犬基因型相近，为同一个属的绦虫。

基于线粒体基因序列构建的遗传进化分析，犬复孔绦虫存在两种基因型，犬复孔绦虫犬基因型和犬复孔绦虫猫基因型，并通过混合性感染试验发现其确实为2个不同的基因型，提示犬复孔绦虫有2个适应不同宿主的基因型[19-20]。采用ML构建的进化树，显示本研究中的3个虫体与D.caninum犬基因型和D.caninum猫基因型都位于同一分支，与D.caninum犬基因型亲缘关系最近，同源性最高，与D.caninum猫基因型有一些分离，在一定程度上，提示犬复孔绦虫是一个复合体，这一结论与国内外相关学者对犬复孔绦虫的线粒体基因序列分析一致[5,18-21]，进一步支持犬复孔绦虫存在2个适应不同宿主的虫株这一结论。3条虫体所属分支与圆叶目绦虫构成一大分支，而与假叶目绦虫所属分支较远,说明cox1和nad1可作为理想的遗传标记用于绦虫分类和进化研究中，这也为犬复孔绦虫病的诊断、分子流行病学调查和防控奠定基础。