新疆南疆部分地方品种羊无浆体的分子检测与鉴定

金紫薇，罗慧丽，石文玉，辛园园，郎 平，薛芙蓉，陶大勇，赵爱云，齐 萌

(塔里木大学动物科学学院 新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆阿拉尔 843300)

无浆体(Anaplasma)是常见的蜱传染病原体之一，可引起人和多种动物消瘦、贫血、黄疸和胆囊肿大等临床症状，严重感染时可导致死亡，造成较大的危害[1]。在世界范围内，绵羊普遍感染无浆体，以欧洲、美洲和非洲地区更为常见，在突尼斯的调查显示，绵羊的无浆体感染率高达95.0%[2]；我国中部、南部和西北地区的羊只也常感染无浆体，我国中南部地区羊的无浆体感染率为73.9%[3]；伊犁地区牛、羊无浆体感染率均在50%以上[4]。我国已报道羊可感染的无浆体种类主要有绵羊无浆体(A.ovis)、牛无浆体(A.bovis)、嗜吞噬细胞无浆体(A.phagocytophilum)和山羊无浆体(A.capra)[5]，其中，A.phagocytophilum可感染人，存在自然疫源性风险，对人类健康构成潜在的威胁[6]。

我国新疆南疆地方品种绵羊经长期驯化和特殊生活环境选育，形成区域性分布特征，具有抗病力强、适应荒漠环境、早熟和肉质风味独特等优良特性。然而，我国新疆南疆气候独特，蜱及蜱传染病广泛流行，绵羊易感染无浆体，策勒县绵羊无浆体感染率为99.2%[7]；阿克苏地区羊无浆体感染率为41.8%[8]，给养羊业造成了一定的经济损失。本研究采用PCR法对新疆南疆5种地方品种绵羊的无浆体进行检测，调查其感染情况，以期为该地区绵羊无浆体病的防治提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2019年7月至8月，用5 mL EDTA采血管经颈静脉分别采集策勒黑羊(25只)、和田羊(25只)、巴尔楚克羊(10只)、卡拉库尔羊(20只)和多浪羊(20只)血液样本，共100份，依次编号；圈养和散养的绵羊各50只；冷藏箱保存送至实验室4℃保存，2周内提取血液基因组DNA。

1.1.2 主要试剂与仪器 血液基因组DNA提取试剂盒，上海莱枫生物科技有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix (+dye)与DNA Marker DL 2 000，北京全式金生物技术有限公司；Sorvall Legend Micro 17型微量离心机，Thermo Scientific公司产品；MC proS型梯度PCR仪，Eppendorf公司产品；DYY-7C型稳压稳流电泳仪和JY系列电泳槽，北京市六一生物科技有限公司产品；Gel Doc XR+型凝胶成像系统，Bio-Rad 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 血液DNA提取 每份血液样本取200 μL，按照血液基因组DNA提取试剂盒中的说明书操作步骤提取血液DNA。

1.2.2 PCR扩增 参照文献[9]设计A.ovis的MSP4基因、A.phagocytophilum和A.bovis的SSU rRNA基因位点设计种特异性引物，对所有提取的绵羊血液DNA进行PCR扩增。A.ovis的MSP4基因第1轮PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，25个循环；72℃ 10 min；第2轮扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。A.phagocytophilum和A.bovis的SSU rRNA基因第1轮PCR扩增条件均为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min；第2轮扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。参照文献[10]设计羊的A.capra的gltA基因位点通用引物，对所有提取的绵羊血液DNA进行PCR扩增。A.capra的gltA基因第1轮PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，25个循环；72℃ 10 min；第2轮扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。引物由苏州金维智生物科技有限公司合成，引物序列和目的片段见表1。PCR扩增为25 μL反应体系：模板DNA1 μL，2× EasyTaqPCR SuperMix (+dye)12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL，双蒸水10.9 μL。每轮PCR扩增均设阳性对照(阳性DNA样本)和阴性对照(双蒸水)。PCR扩增结束后，取5μL产物通过10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统内拍照保存。

表1 引物序列和目的片段Table 1 Primer sequences and fragment length

1.2.3 序列比对分析 PCR产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行双向测序，所获序列在NCBI中进行Blast，下载同源序列，采用Clustal X 2.1软件进行序列比对，根据系列分析鉴定无浆体的种类。

2 结果

2.1 血液样本DNA的PCR扩增结果

分别用A.ovis、A.phagocytophilum、A.bovis和A.capra种特异性引物对100份血液样本DNA进行PCR扩增，分别扩增出65份A.ovis(图1)和14份A.phagocytophilum目的条带(图2)，与阳性样本目的条带相一致；未扩增出A.bovis和A.capra目的条带。

M.DNA标准DL 2 000；1～8.样本；N.阴性对照；P.阳性对照M.DNA Marker DL 2 000;1-8.Samples;N.Negative control;P.Positive control图1 部分绵羊血液DNA样本基于绵羊无浆体MSP4基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR result of the MSP4 gene of A.ovis in some blood DNA samples of sheep

M.DNA标准DL 2 000；1～8.样本；N.阴性对照；P.阳性对照M.DNA marker DL 2 000;1-8.Samples;N.Negative control;P.Positive control图2 部分绵羊血液DNA样本基于嗜吞噬细胞无浆体SSU rRNA基因的PCR扩增结果Fig.2 PCR result of the SSU rRNA gene of A.phagocytophilum in some blood DNA samples of sheep

2.2 南疆部分地方品种羊的无浆体感染情况

对100份地区品种羊血液DNA样本进行PCR检测，有67份呈无浆体阳性，总感染率为67.0%(67/100)，其中A.ovis感染率为65.0%(65/100)，A.phagocytophilum感染率为14.0%(14/100)，A.ovis和A.phagocytophilum混合感染率为12.0%(12/100)。5种地方品种羊均发现有无浆体感染，以多浪羊感染率最高，为100.0% (20/20)，和田羊感染率最低，为44.0%(11/25)；5种地方品种羊均发现有A.ovis感染，以多浪羊感染率最高，为100%(20/20)，巴尔楚克羊感染率最低，为30.0%(3/10)；5种地方品种羊均发现有A.phagocytophilum感染，以多浪羊感染率最高，为25.0%(5/20)，策勒黑羊感染率最低，为4.0%(1/25)(表2)。

表2 新疆南疆不同地方品种羊的无浆体感染情况Table 2 Prevalence of Anaplasma spp.in some local breeds of sheep in Southern Xinjiang

2.3 不同养殖条件地方品种羊的无浆体感染情况

对50份圈养地方品种羊的血液DNA样本进行PCR检测，有30份呈无浆体阳性，感染率为60.0%(30/50)，其中A.ovis和A.phagocytophilum感染率分别为60.0%(30/50)和4.0% (2/50)，混合感染率为4.0%(2/50)；对50份散养地方品种羊的血液DNA样本进行PCR检测，有37份呈无浆体阳性，感染率为74.0%(37/50)，其中A.ovis和A.phagocytophilum感染率分别为70.0%(35/50)和24.0%(12/50)，混合感染率为20.0%(10/50)(表3)。

表3 不同养殖模式条件下地方品种羊的无浆体感染情况Table 3 Prevalence of Anaplasma spp.in local breeds of sheep in different feeding patterns

2.4 种类鉴定和序列分析

65份A.ovis的PCR扩增产物均成功双向测序，经序列比对分析，均鉴定为A.ovis，存在3个基因型，分别命名为基因型AO1(n=40)、基因型AO2(n=12)和基因型AO3(n=13)。基因型AO1(n=40)与我国新疆绵羊源A.ovis(KJ782401)的序列同源性为100.0%；基因型AO2(n=12)与突尼斯绵羊源A.ovis(KM285221)的序列同源性为100.0%；基因型AO3(n=13)与我国新疆绵羊源A.ovis(KJ782404)的序列同源性为100.0%。

14份A.phagocytophilum的PCR扩增产物均成功双向测序，经序列比对分析，均鉴定为A.phagocytophilum，存在3个基因型，分别命名为基因型AP1(n=12)、基因型AP2(n=1)和基因型AP3(n=1)。基因型AP1和基因型AP2的序列分别与我国新疆绵羊源A.phagocytophilum(KJ782381)和(KJ782386)的序列同源性为100.0%；基因型AP3的序列与新疆绵羊源A.phagocytophilum(KJ782381)有2个碱基位点的差异，在312碱基位置核苷酸G→A，在443碱基位置核苷酸T→C。

3 讨论

无浆体病是多种无浆体引起的自然疫源性疾病之一，在我国尤其是牧区流行更为严重，其中对羊危害较大的是A.ovis和A.phagocytophilum，常可引起患羊增重减缓、产奶量下降及流产，但急性发病时亦可导致死亡，造成较大的经济损失[3,5,9]。用PCR法检测我国6个省份绵羊和山羊的无浆体，发现感染率为36.2%(205/567)和58.2%(105/251)[11]；甘肃省羊的无浆体感染率为30.6%(76/219)[12]；安徽省羊的无浆体感染率为33.0%(67/203)[13]；策勒县绵羊的无浆体感染率为99.2% (119/120)[7]。本次发现新疆南疆5种地方品种羊的无浆体总感染率为67.0%(67/100)，与上述调查结果相一致，不同地区羊的无浆体感染率存在一定差异，可能与地理区域和病媒蜱的分布特点有一定关联。

在新疆西部和南部地区调查发现,羊的A.ovis和A.phagocytophilum感染率分别为40.5%(51/125)和28.8%(36/125)[14]；阿克苏地区羊的A.ovis和A.phagocytophilum的感染分别为33.16%(320/965)和29.43%(284/965)[8]。本次调查发现，A.ovis感染率65.0%(65/100)高于A.phagocytophilum感染率14.0%(14/100)，与上述报道相一致。近年来，A.phagocytophilum在湖南、山西和新疆等地区人的血液样本中检测到，提示其具有人兽共患风险，应进一步加强人兽共患无浆体病的检测与防控，保障人畜健康[15-16]。

河南省放牧湖羊无浆体感染率为68.4%(26/38)，明显高于舍饲湖羊感染率22.1%(28/127)[17]。从我国12个县区采集300份奶山羊血液样品进行无浆体检测，发现放牧奶山羊感染率为48.2%(67/139)[9]，明显高于舍饲奶山羊感染率1.2%(2/161)。本次调查结果与以上研究结果相一致，散养羊无浆体感染率74.0%(37/50)高于圈养羊的感染率60.0%(30/50)，提示圈养羊可能因其养殖方式及定期驱虫减少了与病媒蜱接触的机会；而散养羊在放牧过程中更易与蜱接触，被蜱叮咬几率增加导致无浆体感染率上升。本次调查显示，南疆不同地方品种绵羊的无浆体感染情况存在差异，放牧条件下较舍饲条件下更易感染无浆体，养殖过程中应进一步加强羊体表寄生蜱的检查与防治。