宁夏吴忠地区奶牛临床型乳房炎主要病原菌的分离鉴定及耐药性分析

宋 倩，达举云，李怡娜，史金莲，李宗帅，赵兴绪，张 勇

(甘肃农业大学动物医学院/甘肃省动物生殖生理及繁殖调控重点实验室，甘肃兰州 730070)

奶牛乳房炎(Cow mastitis)由多种因素引起，如环境因素、挤奶方式及饲养管理等，其防治比较困难[1-2]。真菌、细菌、支原体和病毒都可引起乳房炎的发生，根据病原的来源和传播途径，可将其分为环境性病原和接触传染性病原两大类[3-4]。生产实际中多种病原菌混合感染引发的乳房炎比较常见[5]。临床型乳房炎奶牛主要表现为乳房肿胀，食欲减退，体温升高，乳汁稀薄并伴有絮状物，严重时乳汁中会伴随血液，乳房触摸时质地坚硬[6]。患病奶牛的乳汁品质下降，严重降低了养殖经济效益。对于罹患乳房炎的奶牛治疗主要以抗菌药物为主[7]，乱用或者滥用抗生素进行治疗会使乳汁中残留抗生素，危害人类健康[8]。本试验主要以宁夏吴忠地区的临床型乳房炎为研究对象，从吴忠地区3个大型奶牛场采集乳样，进行病原菌的分离、革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA序列分析、药敏试验、耐药基因检测，分析病原菌的耐药情况，为该地区奶牛乳房炎的治疗和预防用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 采集宁夏吴忠地区临床型乳房炎乳样56份作为细菌分离的病料。

1.1.2 主要试剂 无菌脱纤维绵羊血，南京森贝伽生物科技有限公司；营养肉汤，琼脂粉，MHB培养基，革兰氏染液，北京索莱宝科技有限公司；药敏试纸，细菌微量生化鉴定管，杭州滨和微生物试剂有限公司；山羊血清，天津康源生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 恒温振荡器，常州国华电器有限公司；生物安全柜，苏州赛默飞世尔科技有限公司；Eppendorf离心机，北京艾本德中国有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；生物显微镜，英菲洛精密科技(苏州)有限公司；PCR仪，凝胶成像系统，伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 根据兰州乳房炎检测法及动物临床症状(具有乳腺组织出现肿胀、体温升高、乳汁稀薄并伴有絮状物或血液等)，从宁夏吴忠地区的3个奶牛场分别采集乳房炎患病奶牛乳样共计56份。采集乳样时，对乳区进行碘伏擦拭消毒，丢弃前3把乳样后进行采集。

1.2.2 细菌的分离纯化 无菌条件下，将混匀的乳样接种至50 mL/L脱纤维绵羊血琼脂平板，37℃恒温培养24 h，进行革兰氏染色，镜检。挑取典型的单菌落编号：革兰氏阴性杆菌的编号为W1，W2，W3，…共13株；革兰氏阳性链球菌的编号为WZ1，WZ2，WZ3，…共8株。

1.2.3 细菌的生化鉴定 生化试验按照《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]进行，对分离出的革兰氏阴性杆菌进行蔗糖试验、乳糖试验、甘露醇试验、MR试验、VP试验、吲哚试验、枸橼酸盐试验、硫化氢试验；对分离出的革兰氏阳性链球菌进行蔗糖试验、乳糖试验、甘露醇试验、触酶试验、马尿酸钠试验、七叶苷试验、CAMP试验。接种环移取少量纯化培养物至细菌微量生化反应管内，在35℃培养箱内恒温培养12 h,按照《伯杰氏鉴定细菌学手册》的方法进行观察[9]。

1.2.4 16S rRNA鉴定 根据细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根)的提取步骤进行DNA提取。以细菌16S rRNA通用引物为引物，序列为：F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT，提取的细菌DNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为：上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×Taq PCR Master MIX 15 μL，ddH2O 7 μL。扩增程序为：95℃ 3 min；95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min，34个循环；72℃ 5 min。取7 μL的PCR扩增产物在含10 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳。将条带单一的PCR扩增产物送至兰州天启生物科技有限公司测序，测序结果于NCBI官网上进行Blast比对分析。

1.2.5 构建16SrRNA系统发育进化树 在GenBank对16S rRNA测序结果进行Blast比对，并下载相似度较高的序列作为参考序列，使用MEGA5.0软件构建系统发育进化树。

1.2.6 药敏试验 采用KB纸片扩散法对分离菌进行复方新诺明、头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、卡那霉素、庆大霉素、头孢噻肟、头孢曲松、哌拉西林、头孢他啶、阿米卡星、青霉素G、环丙沙星、四环素、克拉霉素、克林霉素、万古霉素、红霉素等药物的敏感性试验。

接种环蘸取纯化的菌落后，使用无菌生理盐水分别将其稀释为0.5麦氏比浊度的菌液[10]。取100 μL至MHB培养基上，用涂布棒涂抹均匀，于37℃恒温培养18 h。使用游标卡尺对抑菌圈进行测量，根据抑菌圈直径大小判定其敏感性。

1.2.7 耐药基因检测 参考文献[11-13] 合成sul1、sul2、aacC2、aacC4等15种耐药基因引物，引物通过兰州天启生物科技有限公司进行合成。扩增体系为：上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master MIX 10 μL，ddH2O 8 μL。扩增程序为：95℃ 3 min；95℃ 30 s,55℃～62℃ 30 s,72℃ 1 min,34个循环；72℃ 5 min。

2 结果

2.1 革兰氏染色结果

革兰氏染色结果经镜检观察，分离出革兰氏阴性杆菌13株，染色特征为两段钝圆，中等大小，单个存在(图1)；分离出革兰氏阳性链球菌8株，染色特征为呈双或者短链、长链状排列(图2)。

图1 革兰氏阴性杆菌染色特征Fig.1 Gram-negative bacilli staining characteristics

图2 革兰氏阳性链球菌染色特征Fig.2 Gram-positive Streptococcus staining characteristics

2.2 生化鉴定结果

2.2.1 革兰氏阴性杆菌生化鉴定结果 分离出的革兰氏阴性杆菌乙酰甲基甲醇试验(VP)、枸橼酸盐利用试验以及硫化氢试验均呈阴性，吲哚试验均呈阳性，其中有3株不分解蔗糖，2株不分解乳糖，3株不分解甘露醇，3株甲基红试验(MR)呈阴性。结果显示，分离出的革兰氏阴性杆菌菌株与大肠埃希氏菌具有相似的生化特性(表1)。

表1 革兰氏阴性杆菌生化鉴定结果Table 1 Biochemical identification results of Gram-negative bacilli

2.2.2 革兰氏阳性链球菌生化鉴定结果 分离出的革兰氏阳性链球菌均可分解蔗糖和乳糖，不分解甘露醇，马尿酸钠与CAMP试验均呈阳性，七叶苷与触酶试验呈阴性。结果显示，分离出的革兰氏阳性链球菌菌株与无乳链球菌具有相似的生化特性(表2)。

表2 革兰氏阳性链球菌生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results of Gram-positive Streptococcus

2.3 16S rRNA鉴定

2.3.1 革兰氏阴性杆菌16S rRNA PCR产物电泳结果 分离出的革兰氏阴性杆菌16S RNA扩增长度均在1 400 bp～1 500 bp(图3)，与预期结果相符。

M.DNA标准DL 2 000;1～13:W1～W13M.DNA Marker DL 2 000;1-13:W1-W13图3 分离的革兰氏阴性杆菌16S rRNA PCR扩增结果Fig.3 16S rRNA PCR amplification results of isolated Gram-negative bacillus strains

2.3.2 革兰氏阳性链球菌16S rRNA PCR产物电泳结果 分离出的13株革兰氏阳性链球菌16S RNA扩增长度均在1 400 bp～1 500 bp(图4)，与预期结果相符。经过革兰氏染色、生化鉴定、以及16S rRNA鉴定结果显示，共分离出13株大肠埃希氏菌和8株无乳链球菌。

M.DNA标准DL 2 000;1～13:WZ1～WZ8M.DNA Marker DL 2 000;1-13:WZ1-WZ8图4 分离的革兰氏阳性链球菌16S rRNA PCR扩增结果Fig.4 16S rRNA PCR amplification results of isolation of Gram-positive Streptococcus strains

2.4 构建16S rRNA系统发育进化树

2.4.1 13株大肠埃希氏菌16S rRNA系统发育进化树 针对于分离出的大肠埃希氏菌构建16S rRNA系统发育进化树，结果分4个组别，其中W6独自为一个分支，表明与其他菌株相比差异性较大。W11与剩下的相比，又为一个单独的分支，W2、W4、W5、W7、W9为一个分支，W1、W3、W8、W10为一个分支，W12、W13分别在单独的分支上(图5)。

图5 13株大肠埃希氏菌16S rRNA系统发育进化树Fig.5 The phylogenetic tree of 13 strains of Escherichia coli 16S rRNA

2.4.2 8株无乳链球菌16S rRNA系统发育进化树 针对于分离出的无乳链球菌构建16S rRNA系统发育进化树，结果分为4个组别，其中WZ5和WZ7在一个分支上，差异性不大；WZ2、WZ4、WZ8在一个分支上，表明它们之间差异不大；WZ1、WZ6、WZ3则在另一个分支上(图6)。

图6 8株无乳链球菌16S rRNA系统发育进化树Fig.6 The phylogenetic tree of 8 strains of Streptococcus agalactiae 16S rRNA

2.5 药敏试验结果

2.5.1 大肠埃希氏菌药敏试验结果 13株大肠埃希氏菌对12种常见药物都出现了不同程度的耐药。其中头孢噻吩和复方新诺明的耐药率高于50%，在治疗时可以避免选择使用头孢噻吩和复方新诺明。13株大肠埃希氏菌对链霉素、卡那霉素、头孢曲松的敏感率低于50%，但是中介率分别都在30%以上。13株大肠埃希氏菌对环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素、头孢噻肟、哌拉西林、头孢他啶、阿米卡星的敏感率达到50%以上，特别是头孢他啶和环丙沙星的敏感率分别达到76.9%和84.6%(表3)。

表3 分离的13株大肠埃希氏菌对常见的12种药物敏感试验Table 3 Sensitivity test of 13 isolated strains of Escherichia coli to 12 common drugs

2.5.2 无乳链球菌药敏试验结果 分离出的8株无乳链球菌对11种常见药物均表现出不同程度的耐药。特别是对青霉素G、复方新诺明、克拉霉素、克林霉素、万古霉素、红霉素、庆大霉素这7种药物的耐药率可达60%以上，其中对青霉素G和复方新诺明耐药率达87.5%。四环素和卡那霉素的耐药率和敏感率均是50%；环丙沙星的耐药率为0，分别表现出高度敏感和中度敏感；分离出的8株无乳链球菌对阿米卡星表现为高度敏感性，敏感率达到75%(表4)。

表4 分离的8株无乳链球菌对常见的11种药物敏感试验Table 4 Sensitivity test of 8 strains of Streptococcus agalactiae to 11 common drugs

2.5.3 大肠埃希氏菌、无乳链球菌的多重耐药性 从分离出的大肠埃希氏菌和无乳链球菌的多重耐药结果显示，13株大肠埃希氏菌中有6株分别对3种、4种、5种、6种、8种和9种药物耐药，多重耐药率可达46%。无乳链球菌有2株分别对5种、6种药物耐药，2株对9种药物耐药，2株对10种药物耐药，多重耐药率可达75%。无乳链球菌的耐药情况比较严重，都出现了对10种药物耐药的菌株(图7)。

图7 多重耐药结果Fig.7 Multi-drug resistance results

2.7 耐药基因检测结果

2.7.1 大肠埃希氏菌耐药基因检测结果 13株大肠埃希氏菌通过PCR检测15种耐药基因，结果为：sul1的检出率为84.6%，TEM的检出率为76.9%，pbp2B的检出率为61.5%，sul2的检出率为38.4%，tetA的检出率为23.1%，gyrA的检出率为15.4%，aacC2、tetM的检出率为7.7%，aacC4、addA、pbp1A、OXA、IMP、DHA、parC的检出率均为0。部分菌株耐药基因sul1(263 bp)、sul1(236 bp)、aacC2(648 bp)、tetM(568 bp)、pbp2B(268 bp)、TEM(259 bp)均检出，其余耐药基因均未检出(图8)。

M.DNA Marker DL 2 000;1～15.sul1、sul2、aacC2、aacC4、tetM、addA、tetA、pbp1A、pbp2B、TEM、OXA、IMP、DHA、gyrA、parC

2.7.1 无乳链球菌耐药基因检测结果 8株无乳链球菌通过PCR检测15种耐药基因，结果为：sul1、sul2、pbp1A、pbp2B、TEM的检出率为100%,aacC2的检出率为50%，OXA的检出率为25%，gyrA、parC、addA的检出率为12.5%，aacC4、tetM、tetA、IMP、DHA的检出率为0。部分菌株耐药基因sul1(263 bp)、sul2(236 bp)、aacC2(648 bp)、pbp1A(489 bp)、pbp2B(268 bp)、TEM(259 bp)、gyrA(474 bp)、parC(568 bp)均检出，其余未检出(图9)。

M.DNA Marker DL 2 000;1～15:sul1、sul2、aacC2、aacC4、tetM、addA、tetA、pbp1A、pbp2B、TEM、OXA、IMP、DHA、gyrA、parC图9 部分菌株15种耐药基因检测结果Fig.9 Detection results of 15 drug resistance genes in selected strains

3 讨论

奶牛乳房炎是一种常见的疾病，主要致病菌为大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌,对奶牛养殖造成极大的危害[14-15]。宁夏吴忠地区主要分离菌大肠埃希氏菌和无乳链球菌是引起该地区奶牛乳房炎发生的主要病原菌,不同地区的相同病原菌对抗生素的耐药程度也有差异。该地区分离出的大肠埃希氏菌和无乳链球菌两种病原菌主要对头孢他啶、阿米卡星和环丙沙星比较敏感，对头孢噻吩、青霉素G和复方新诺明耐药性较高，这与薛梅等对山东潍坊奶牛乳房炎病原菌主要对青霉素耐药的结果相同，对四环素耐药的结果有差异[16]，这可能是由于地区不同，病原菌对药物的敏感性不同所造成的。新疆地区奶牛乳房炎分离出的无乳链球菌主要对青霉素耐药[17],这与本地区无乳链球菌对青霉素耐药的结果一致。

经耐药基因检测发现，大肠埃希氏菌对磺胺类sul1、sul2基因的检出率较高，这与大肠埃希氏菌对复方新诺明耐药性较高相符合，也与姚伟等对辽宁地区大肠埃希氏菌耐药基因检测结果相近，都是磺胺类耐药基因检出率高[18]，可能是由于磺胺类药物的滥用，导致不同地区的大肠埃希氏菌对其产生了耐药性。大肠埃希氏菌氨基糖苷类aacC2、aacC4耐药基因的检出率低，经药敏试验结果显示大肠埃希氏菌对于妥布霉素、卡那霉素、庆大霉素以及阿米卡星的总体的敏感率较高，结果也相符。关于β-内酰胺类耐药基因pbp2B、TEM的检出率较高，这与药敏试验对于头孢曲松相对于耐药相符；这与张震等所报道blaTEM基因携带率(最高为90.1%)相差不大[19]，TEM在大肠埃希氏菌中的检出率普遍较高。对于头孢他啶的敏感性较高可能与β-内酰胺类耐药基因pbp1A、OXA、IMP、DHA的检出率均为0有关。氟喹诺酮类基因gyrA的检出率为15.4%、parC的检出率为0，这与大肠埃希氏菌对环丙沙星较敏感的结果相对应。

无乳链球菌经耐药性基因检测发现其对sul1、sul2、pbp1A、pbp2B、TEM的检出率为100%,与药敏试验结果结合后发现该地区无乳链球菌确实对复方新诺明、和青霉素G高度耐药相符；对于gyrA、parC的检出率为12.5%，药敏试验结果表明无乳链球菌对与环丙沙星表现出高度敏感和中度敏感相对应。一般来说，耐药基因检出率越高，则相对应的药敏试验的耐药性就越高；耐药基因的检出率越低，则相对应的药敏试验的敏感性则越高[20]。对比本试验对于四环素类耐药基因检出率低，但试验结果表明对四环素只存在50%的敏感率，从菌株而言，可能存在对其他四环素类耐药基因检出。本试验分离得到的无乳链球菌主要表现出对β-内酰胺类药物耐药率较高，这与王爱媛[12]等对海南地区无乳链球菌耐药基因研究相一致，可能是由于β-内酰胺类药物被作为治疗无乳链球菌的一线药物被广泛推荐使用，导致细菌产生了耐药性。通过检测大肠埃希氏菌和无乳链球菌的耐药基因，并结合药敏结果，为宁夏吴忠地区奶牛乳房炎的临床治疗和预防用药提供了参考依据。