中药复方对猪源多重耐药大肠埃希氏菌的耐药性消除研究

李志君，鲁孟佳，张 雯，崔生玲，卿素珠，范云鹏，麻武仁，刘迎秋，杨 奇*，张为民*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.宁夏回族自治区兽药饲料监察所，宁夏银川 750004)

近年来，研究证实中药有助于减少抗菌药物的使用并可以显著地降低病原菌对抗菌药物的耐药性。中药主要从抑制灭活酶活性、消减耐药基因的表达量、抑制外排泵、影响生物被膜的形成和改变细胞膜通透性等方面发挥消除细菌耐药性的作用[1]。例如，穿心莲提取物可下调Ampc基因的表达，从而有效降低细菌生长速度[2]；木糖醇可通过破坏生物被膜的形成来抑制细菌的生长[3]；五味子提取物通过损伤菌体的完整性达到抑制菌株生长的作用[4]。除此之外，许多药用植物的次生产物也可以作为治疗多重耐药细菌感染的有效方法[5]。

中药在临床治疗中主要以复方形式使用，以充分发挥药物的药理作用。因此，本研究依据中药相须配伍原则，选择杨树花、地榆、地锦草、马齿苋等4种清热类中药配伍，以1株猪源多重耐药大肠埃希氏菌为研究对象，研究了4个中药复方对猪源多重耐药大肠埃希氏菌的体外抑制与耐药性消除效果，为中药复方用于临床治疗仔猪腹泻奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与药品 DNA Marker 2 000 bp,北京索莱宝科技有限公司;药敏纸片,杭州滨和微生物试剂有限公司;2×EsTaqMaserMix(Dye),康为世纪生物科技有限公司;AG RNAex Pro Reagent和反转录试剂盒,湖南艾科瑞生物工程有限公司;琼脂糖，广州赛国生物科技有限公司;杨树花、地锦草和马齿苋均采自西北农林科技大学校园及周边田间，并经薄层色谱鉴定，地榆,杨凌华仁堂大药房。

1.1.2 主要仪器 Nova Nano SEM-45场发射扫描电子显微镜与TECNAI G2 SPIRIT BIO透射电子显微镜，美国FEI公司；荧光定量PCR仪，Bio-Rad公司；TC-XP-G基因扩增仪，杭州博日科技有限公司；水平电泳仪，美国Bio-Red公司。

1.1.3 菌株来源 大肠埃希氏菌来源于仔猪腹泻病例，由西北农林科技大学动物医学院传染病实验室提供，已鉴定为多重耐药大肠埃希氏菌(对氨苄西林、头孢他啶、庆大霉素、大观霉素、卡那霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、四环素、复方新诺明等抗菌药物耐药)；大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922由西北农林科技大学动物医学院微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 中药复方的制备 将杨树花、马齿苋、地锦草、地榆各中药按1∶1的质量比例组合成杨树花-地榆、杨树花-马齿苋、杨树花-地锦草、马齿苋-地榆四种中药复方，煎煮浓缩，使药物终浓度为1 g/mL，置于4℃保存。

1.2.2 中药复方对试验菌株最小抑菌浓度(MIC)的测定 参照文献[6]，采用微量2倍稀释法测定各中药复方对分离的试验菌株的MIC。在96孔板上，用普通营养肉汤将各中药2倍稀释成不同浓度，使得1～10号孔药物浓度分别为500、250、125、62.50、31.25、15.62、7.81、3.90、1.95、0.98 mg/mL，菌液稀释后每孔接100 μL，每组中药重复3次。37℃恒温培养18 h～24 h。肉眼观察澄清无细菌沉淀的孔对应的最小浓度为中药对大肠埃希氏菌的MIC。

1.2.3 中药复方对菌株微观形态的影响 将培养至对数期的试验菌株分别接种于1/2 MIC的含药培养基和不含药培养基，以不加药的菌液为空白对照。置于37℃培养24 h后，收集菌体，按照扫描电镜和透射电镜制样要求处理菌体，观察各中药复方作用后试验菌株微观形态的变化。

1.2.4 中药复方对菌株耐药表型的影响 将培养至对数期的试验菌株接种至含有1/2 MIC药物浓度的肉汤中，37℃培养24 h，此为第1代，取第1代菌液100 μL转接至相同药物浓度的肉汤中，连续培养3代。

将第3代菌液均匀涂布在LB琼脂培养基上，37℃培养18 h～24 h，选取菌落数50～300的培养基，采用影印法将菌落影印在含庆大霉素的培养基和不含抗菌药物的培养基上培养，在含抗菌药物培养基不生长而在不含抗菌药物培养基上生长的菌落为耐药消除菌落。根据耐药消除菌落数与检测的总菌落数之比计算对应中药组方的消除率，并设置阴性对照组。

1.2.5 杨树花-马齿苋对菌株耐药基因相对表达量的影响 采用水煮法提取用药前后试验菌株的DNA，PCR扩增ESBLs基因(blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaOXA)，AMEs基因(aac(3)-Ⅱ、aacC2、aph(3′)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ)和16S rRNA甲基化酶基因(rmtB、armA)，引物序列和反应条件见参照文献[7-9]。

Trizol法提取杨树花-马齿苋作用前后试验菌株的总RNA，根据反转录试剂盒将RNA合成cDNA，以cDNA链为模板、16S为内参基因进行RT-PCR检测。选取aac(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、aacC2这3种耐药基因作为目的扩增基因，用于扩增目的基因的引物序列见表1。试验重复3次，取其平均值，基因相对表达量用2-ΔΔCt法来表示。

表1 多重耐药大肠埃希氏菌耐药基因引物序列Table 1 Primer sequences of drug-resistant genes in multidrug-resistant E.coli

2 结果

2.1 中药复方对试验菌株的MIC测定

杨树花-地榆和杨树花-地锦草组方抑制效果较好，MIC均为62.50 mg/mL，杨树花-马齿苋组方抑菌效果最弱，MIC为250 mg/mL(表2)。

表2 各中药复方对多重耐药大肠埃希氏菌的MIC测定Table 2 MICs of herbal formulas on multidrug-resistant E.coli (mg/mL)

2.2 中药复方作用后试验菌株的微观形态变化

对照组的菌株呈直杆状，两端钝圆，表面光滑，而经中药处理后的各组菌株均呈现了一定程度的形态改变。杨树花-地榆作用后的菌株菌体胀大，表面粗糙并出现破损，个别菌体裂解、可见菌体碎片；杨树花-马齿苋、杨树花-地锦草作用后的菌株菌体胀大，表面粗糙，发生凹陷，未见破损；地榆-马齿苋作用后的菌株仅见菌体胀大，表面粗糙(图1)。各组试验菌株的透射电镜观察见图2。对照组菌株菌体结构完整，细胞壁细胞膜结构清晰，胞质均匀。经4个中药复方作用后的菌株均表现为菌体变形，内部空泡化，细胞膜细胞壁结构模糊，胞质不均匀，除杨树花-地锦草组外，其余3组均发现有部分菌体破裂，内容物溢出。

A.对照组；B～E.杨树花-地榆,杨树花-马齿苋,杨树花-地锦草,地榆-马齿苋处理组(箭头示肿大、凹陷；三角形示破损、碎片)A.Control group；B-E.Flos populi-Sanguisorbae Radix，Flos populi-Portulaca oleracea，Flos populi-Euphorbia humifuse，Sanguisorbae Radix-Portulaca oleracea(Arrows show swelling and depression；Triangles indicate damage and debris)图1 各组多重耐药大肠埃希氏菌微观形态扫描电镜图(60 000×)Fig.1 Scanning electron microscope image of multidrug-resistant E.coli(60 000×)

A.对照组；B～E.杨树花-地榆,杨树花-马齿苋,杨树花-地锦草,地榆-马齿苋处理组(箭头示肿大、凹陷；三角形示破损、碎片)A.Control group；B-E.Flos populi-Sanguisorbae Radix，Flos populi-Portulaca oleracea，Flos populi-Euphorbia humifuse，Sanguisorbae Radix-Portulaca oleracea(Arrows show swelling and depression；Triangles indicate damage and debris)图2 各组多重耐药大肠埃希氏菌微观形态透射电镜图(13 000×)Fig.2 Transmission electron microscope image of multidrug-resistant E.coli(13 000×)

2.3 中药复方作用后试验菌株的耐药表型变化

4个中药复方对试验菌株的耐药性均有消除作用，消除率均在10.00%以上(表3)，其中以杨树花-马齿苋组方的效果最好，消除率为16.00%。

表3 中药复方对多重耐药大肠埃希氏菌的耐药性消除结果Table 3 Elimination of drug resistance of four Chinese herbal compounds to multidrug-resistant E.coli

2.4 试验菌株的耐药基因检测

PCR检测多重耐药大肠埃希氏菌10种耐药基因中共检出4种，分别为aph(3′)-Ⅱ、aac(3)-Ⅱ、blaOXA、aacC2(图3)。

M.DNA 标准DL 2 000；1.aph(3′)-Ⅱ；2.aac(3)-Ⅱ；3.blaOXA；4.aacC2；-.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000；1.aph(3′)-Ⅱ；2.aac(3)-Ⅱ；3.blaOXA；4.aacC2；-.Negative control图3 大肠埃希氏菌耐药基因检测结果Fig.3 Drug resistance gene test results of E.coli

2.5 杨树花-马齿苋作用后试验菌株的耐药基因相对表达量变化

杨树花-马齿苋作用后，PCR检测试验菌株AMEs 和ESBLs基因，结果显示aacC3-Ⅱ、aacC2、aph(3′)-Ⅱ3种耐药基因均出现丢失现象，而blaOXA基因无显著变化。RT-PCR检测杨树花-马齿苋作用后耐药基因的相对表达量变化(图4)。结果显示，杨树花-马齿苋可以极显著降低多重耐药大肠埃希氏菌耐药基因的表达水平(P<0.01)，aac(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、aacC2耐药基因相对表达量分别下调了40%、89%和92%，表明中药复方可能通过抑制耐药基因的表达来消除细菌耐药性。

图4 杨树花-马齿苋作用后多重耐药大肠埃希氏菌的耐药基因相对表达量变化(**P<0.01)Fig.4 Changes of relative expression of drug-resistant genes in multi-drug resistant E.coli treated with Flos populi-Portulaca oleracea(**P<0.01)

3 讨论

中药复方作用后菌体胀大，表面凹陷、破损，内部空泡化，细菌细胞壁、细胞膜结构模糊等，表明中药可通过破坏细菌细胞壁和细胞膜完整性以达到抑菌目的，与文献[10]的研究结果相似。大肠埃希氏菌经榆栀散复方作用后AKP活性增加[11]，而AKP是一种位于细胞壁与细胞膜之间的细胞内酶，只有细胞壁被损坏，AKP漏出到细胞外环境，才能检测到其活性[12-13]，可见中药复方可以通过影响细菌正常结构来发挥抗菌作用。

中药浓度和培养时间的选择很大程度上影响其消除效果，用1/2 MIC的双黄连对耐药大肠埃希氏菌进行3次传代培养，能有效消除多种抗菌药物耐药性[14]。五倍子水提物可通过抑制16S rRNA甲基化酶的活性，从而降低菌株的耐药性，且1/2MIC比1/4MIC五倍子水提物对耐药基因的作用更明显[15]；厚朴酚也可通过抑制金属β-内酰胺酶的活性来恢复耐药大肠埃希氏菌对美罗培南的敏感性[16]。本研究采用影印法筛选细菌耐药消除子，更能准确地评估中药对细菌的耐药性消除效果，杨树花-马齿苋复方对多重耐药大肠埃希氏菌的耐药消除效果最好，消除率为16.00%。

本研究从4个中药复方中选择了耐药消除效果最好的杨树花-马齿苋复方检测大肠埃希氏菌携带的耐药基因相对表达水平，荧光定量PCR结果表明，杨树花-马齿苋复方可以极显著地降低猪源多重耐药大肠埃希氏菌aac(3)-Ⅱ、aacC2和aph(3′)-Ⅱ耐药基因的相对表达量，从而发挥降低菌株耐药性的作用，表明中药可通过下调主效耐药基因的表达量来消除多重耐药大肠埃希氏菌耐药性。