清肺颗粒HPLC指纹图谱建立及(R,S)-告依春含量测定

刘雪松，张 艳，苏 景，郝敬友，唐 伟，刘彦凯，孙洪杰，徐 丽，薛沾枚，史同瑞*

(1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005；2.黑龙江省动物疫病控制中心，黑龙江哈尔滨 150030；3.哈尔滨绿达生动物药业有限公司，黑龙江哈尔滨 150030)

清肺颗粒是《中华人民共和国兽药典》中收录的经典复方药，由板蓝根、葶苈子、浙贝母、桔梗以及甘草组成，具有清肺平喘、化痰止咳的功效，对发热咳嗽、咽喉肿痛的治疗有非常好的疗效[1-2]。到目前为止，清肺颗粒的质量控制标准仅仅是采用薄层色谱法对几种成分进行鉴定。为了更好地对清肺颗粒的质量进行监测，本试验参考了相关文献[3-4]，建立了清肺颗粒HPLC指纹图谱，并测定了其中(R,S)-告依春的含量，以期为质量控制提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器 岛津LC20-AT液相色谱仪、SPD-M20A二级阵列管检测器、InertSustainC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，日本岛津公司产品；KQ5200B超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；电子分析天平，梅特勒-托利多有限公司产品；Milli-Q型超纯水机，美国密理博公司产品；色谱级甲醇以及乙腈，北京迪科马科技有限公司产品。

1.1.2 药品 (R,S)-告依春对照品(批号111753-202007)，购自中国食品药品检定研究院，含量均大于98%；10批清肺颗粒由黑龙江省农业科学畜牧兽医分院制备；板蓝根、葶苈子、浙贝母、桔梗以及甘草购自黑龙江省齐齐哈尔市不同中药店，经过鉴定均为正品，均符合2015年版《中国药典》的相关规定。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 流动相为乙腈-5 mL/L甲酸，梯度洗脱(0～30 min 50 mL/L～840 mL/L乙腈；30 min～40 min 840 mL/L～950 mL/L乙腈；40 min～50 min 950 mL/L～50 mL/L乙腈；50 min～60 min 50 mL/L乙腈)，体积流量1 mL/min，柱温30℃，检测波长254 nm，进样量 10 μL。

1.2.2 对照品溶液制备 精密称取(R,S)-告依春对照品适量，置于容量瓶中，加入相应适量的乙腈配成浓度为40 μg/mL溶液。

1.2.3 供试品溶液制备 精密称取清肺颗粒20 g，置于锥形瓶中，加入20 mL甲醇，密塞，超声(250 W，50 kHz)30 min，放冷，用甲醇补足丢失的重量，摇匀，滤过。取滤过液加入60 mL无水乙醇，放置在4℃环境下冷藏过夜，4 000 r/min离心10 min后，吸取上清液，过0.22 μm滤膜，进行液相色谱分析。

1.2.4 精密度试验 取清肺颗粒提取液按照1.2.1的色谱方法测定6次，以(R,S)-告依春为参照峰，对该方法的精密度进行试验。

1.2.5 稳定性试验 取清肺颗粒提取液在0、3、6、12、24 h，按照1.2.1的色谱方法进行测定，以(R,S)-告依春为参照峰，对该方法的稳定性进行试验。

1.2.6 重复性试验 平行制备6份清肺颗粒提取液，按照1.2.1的色谱方法进行测定，以(R,S)-告依春为参照峰，对该方法的稳定性进行试验。

1.2.7 指纹图谱的建立 制备清肺颗粒提取物样品溶液10批，10 μL进样分析，选取峰面积大于1%的共有峰积分，以(R,S)-告依春色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，计算各峰相对保留时间和相对峰面积。

1.2.8 相似度分析 采用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A版”。参数设置如下：参照图谱采用第3批样品色谱图作为相似度计算时校正的参照图谱，时间窗宽度为0.10，数据剪切为0～45 min，校正方式采用自动校正结合多点校正。采用平均算法进行指纹图谱的生成。以对照图为参照，各样品指纹图谱与对照图谱进行比较，计算得出各个批次指纹图谱的相似度。

1.2.9 指纹图谱共有峰来源确认 按照清肺颗粒提取液的制作方法，分别制备板蓝根、浙贝母、甘草、葶苈子以及桔梗的单味药材样品溶液，按照相同的色谱方法进行分析，分别将单味药的色谱图与指纹图谱共有峰图进行对比，确认共有峰来源。

1.2.10 (R,S)-告依春含量测定 精密吸取供试品以及板蓝根缺失样品溶液，按照1.2.1色谱方法进行测定，精密吸取对照品溶液0.5、1、5、10、15 mL，置于25 mL容量瓶中，加乙腈稀释，超声。按照1.2.1色谱条件进行测定。以定量色谱峰面积为纵坐标，以药物浓度为横坐标，建立标准曲线。对该方法的精密度、重复性、稳定性进行试验。精密称取板蓝根缺失清肺颗粒，平均分成3份，按照80%、100%、120%水平加入(R,S)-告依春对照品溶液，按照1.2.3的方法制备供试品溶液，按照1.2.1的方法检测，测定(R,S)-告依春加样回收率，并运用该方法测定清肺颗粒中的(R,S)-告依春含量。

2 结果

2.1 方法学专属性

在精密度试验、稳定性试验以及重复性试验中，皆以1号峰(R,S)-告依春峰为参照峰，其中在精密度试验中各共有峰相对保留时间RSD小于0.98%，相对峰面积RSD小于2.96%，表明精密度良好。稳定性试验中，各共有峰相对保留时间RSD小于0.94%，相对峰面积RSD小于2.62%，表明稳定性良好。在重复性试验中，各共有峰相对保留时间RSD小于0.71%，相对峰面积RSD小于2.89%，说明重复性良好。用该HPLC方法可以进行清肺颗粒指纹图谱的建立。

2.2 相似度评价

按照1.2.3的方法进行供试品制备，1.2.1的方法进行测定(图1),共标定出12个共有峰，其中通过相对保留时间以及光谱图可以看出1号峰为(R,S)-告依春(图2)。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A)进行分析，以S3为参照峰进行色谱峰自动匹配，采用平均算法生成对照图谱，测定10批样品相似度分别为0.982、0.98、0.971、0.982、0.978、0.975、0.981、0.991、0.973、0.988，均大于0.9，说明各批次之间的质量相对稳定。

图1 10批清肺颗粒指纹图谱叠加图Fig.1 Fingerprint overlay of 10 batches of Qingfei granules

2.3 共有峰归属

通过对比确认了1、2、3、6、7、8、9号峰来自于板蓝根，2、6、8号峰来自于葶苈子，2、3、9、10号峰来自于甘草，4、5、7、11号峰来自于贝母，7和12号峰来自于桔梗(图3)。

a.清肺颗粒；b.对照品a.Qingfei granules;b.Control solution图2 清肺颗粒提取液与对照品溶液中(R,S)-告依春对比Fig.2 Comparisons of epigoitrin in Qingfei granules extract and control solution

图3 各个药材共有峰色谱图Fig.3 Chromatogram of common peaks of each medicinal material

2.4 (R,S)-告依春含量测定

精密吸取供试品溶液以及板蓝根阴性缺失溶液，按照1.2.1的色谱方法进行测定(图4)。在板蓝根阴性缺失溶液中，没有供试品溶液中(R,S)-告依春处的色谱峰，说明方法的专属性良好。以定量色谱峰面积为纵坐标，以药物浓度为横坐标，建立标准曲线。该标准曲线相关系数为0.996 9，方程为y=1.060 5x-2.157 6。精密度试验中测得(R,S)-告依春峰面积RSD为0.73%，稳定性试验中测得(R,S)-告依春峰面积RSD为0.86%，重复性试验中测得(R,S)-告依春峰面积RSD为1.53%。该结果表明该方法的精密度、稳定性以及重复性良好。加样回收率试验中，测得(R,S)-告依春加样回收率为98.63%，RSD为1.56%。运用该方法测定10批清肺颗粒中(R,S)-告依春含量，结果见表1。

表1 (R,S)-告依春含量测定(n=5)Table 1 Determination of the content of epigoitrin(n=5)

图4 方法专属性图Fig.4 Chromatogram of method specificity

3 讨论

清肺颗粒中的板蓝根、葶苈子、甘草、桔梗以及浙贝母具有清热解毒、凉血利咽、补中益气、润肺止咳、清热解毒等作用，对于抗氧化、抗炎、调节免疫以及解毒抗癌等具有良好的效果[5-8]。清肺颗粒具有清肺平喘、化痰止咳的功效，对于治疗动物的感冒、发热、咳嗽等疾病有较好疗效。

本试验比较了乙腈-水流动相系统以及乙腈-5 mL/L甲酸流动相系统的差别，并在选择出峰数目适中、峰面积适中以及分离度较好的流动相的情况下，筛选出适合的检测波长。经过对比后，发现乙腈-5 mL/L甲酸流动相更加适合清肺颗粒指纹图谱的建立。在流动相中加入酸性试剂，可以抑制复方药中某些酸性成分的电离，从而使其保持着游离状态，便于液相色谱的检测，并且加入酸性试剂也有利于改善色谱峰的峰形以及分离度，让HPLC指纹图谱方法更加有效地进行质量控制的检测[4]。对比了254、280、300、350 nm检测波长下色谱图的差异，发现300 nm以及350 nm检测波长下，出峰数目显著小于254 nm以及280 nm。254 nm以及280 nm处的出峰数目、峰面积以及分离度差异不显著，但是考虑到(R,S)-告依春的检测波长一般为245 nm，故选择254 nm为本次试验的检测波长[10]。

通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)发现了10批清肺颗粒中共有12个共有峰，其中板蓝根有7个共有峰，葶苈子有3个共有峰，甘草有4个共有峰，浙贝母有4个共有峰，桔梗有2个共有峰。这其中板蓝根的共有峰最多。发现各个药材中存在着共有峰交差现象。造成这种现象的原因可能是因为中药单味药材经过提取后成分复杂，包括了多糖类、黄酮类以及木质素类等物质[11-12]。引起这种共有峰交差存在的现象有可能是不同种药材中存在着相似的有效成分，并且这些物质的紫外吸收光谱相近导致的。

(R,S)-告依春是板蓝根中主要的芥子苷类成分，与板蓝根的用药功能主治相关且为专属性成分。(R,S)-告依春具有抗菌、抗病毒以及抗内毒素等作用[13]。许多中药复方制剂中都以(R,S)-告依春的含量为指标进行质量控制。夏金松等就用高效液相色谱法检测扶正解毒微粉中(R,S)-告依春含量，测得10批扶正解毒微粉中(R,S)-告依春平均含量为0.026%[14]。陈路等就采用高效液相色谱法测定板山岗颗粒中(R,S)-告依春含量，得出板山岗颗粒中(R,S)-告依春平均含量为0.065 5 mg/g[15]。本试验采用高效液相色谱的方法建立了清肺颗粒指纹图谱并且测定了(R,S)-告依春的含量，通过建立的方法对清肺颗粒的质量控制提供依据。