乌鲁木齐市犬体表寄生蜱形态学及分子生物学鉴定

刘一凡，阿力木江·加帕尔，叶尔保勒，祖力亚·克力木江，韦丽婷，翟雪洁，巴音查汗·盖力克，王振宝*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.伊宁海关，新疆伊宁 835000)

蜱属于节肢动物门(Arthropod)、蛛形纲(Arachnida)、蜱螨目(Acarina)、蜱亚目(Ixodides)、硬蜱科(Ixodidea)，是广泛寄生于哺乳动物、爬行类、鸟类和两栖类等脊椎动物(鱼类除外)体表的节肢动物[1]。蜱虫作为一种专性吸血的体外寄生动物，是仅次于蚊子的第二大虫媒介生物[2]，在全球范围对人畜健康造成很大危害[3]。蜱虫在叮咬宿主动物的同时释放出毒素，储存和传播多种严重的自然疫源性疾病及人兽共患病的病原[4-5]，如立克次体、无形体、犬埃立克体、贝氏柯克斯体、莱姆病螺旋体、巴贝斯虫、泰勒焦虫等[6-7]。我国常见寄生于犬体表的蜱有血红扇头蜱[8]、微小牛蜱[9]、镰形扇头蜱、长角血蜱[10]、铃头血蜱和草原血蜱[11-12]，其中以血红扇头蜱为优势蜱种，这说明犬是多种蜱种的宿主，这些蜱虫常在雨后潮湿闷热的环境中在草地、灌木丛穿行的犬体表大量出现。据报道表明，图兰扇头蜱为新疆的优势蜱种[13]常寄生于羊、牛、马等家畜[14]，主要分布在新疆的喀什、和田、轮台、沙雅、霍城、哈密、库尔勒、阿拉山口等荒漠草原和荒漠地区[15-16]。2015年在新疆伊宁县现发现图兰扇头蜱，这可能与新疆北疆地区近30年雨水量过少、特殊的植被分布及气候变化有关[17]。

对于乌鲁木齐市犬体表蜱虫寄生率及其种群分布特点、蜱虫种类、以及蜱媒传染病，尤其是新发蜱媒传染病的疾病尚不清楚。因此，本试验选取犬体表寄生蜱虫种类作为研究对象，对乌鲁木齐市犬体表的蜱虫寄生的主要蜱虫寄生率及其种类进行了初步调查和鉴定，旨在为进一步研究乌鲁木齐市蜱传病原体带来的公共卫生风险问题提供理论数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蜱虫采集 2020年3月至6月在乌鲁木齐市多家动物医院、宠物店、犬舍、流浪狗基地、社区随机选取无明显发病症状的犬只作为调查对象。采取宿主体表检查法[3]对犬头部、颈部、胸腹部、背部、四肢、腋下、腹股沟、尾部等部位进行检查。经检查获得的蜱虫，使用止血钳夹紧蜱虫头部对其进行采集。将采集到的蜱虫逐一编号并记录宿主信息置于恒温恒湿的阴暗环境中，带回实验室进行后续试验。

1.1.2 主要试剂 2 × EcoTaqPCR SuperMix，北京全式金生物技术有限公司产品；DNA Marker DL 1000，北京全式金生物技术有限公司产品；TIANGEN基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 LEICA M205 FA徕卡体视显微镜多重聚焦系统，德国徕卡仪器(中国)有限公司产品；RETSCH MM400混合冷冻混合球磨仪，费尔德(上海)仪器设备有限公司产品；AllegraTM X-22R Centrifuge多功能冷冻台式离心机，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司产品；Biometre TProfessional TRIO 48三槽高速热循环仪，上海昆士兰生物科技发展有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 形态学鉴定 用蒸馏水将采集到的蜱虫反复冲洗3次后置于700 mL/L乙醇中保存备用。参照《新疆蜱类志》[14]，利用普通体视显微镜进行形态学初步观察，再利用LEICA M205 FA徕卡体视显微镜多重聚焦系统进一步进行形态学分析及蜱种鉴定，对蜱虫的假头基、盾板、气门板、生殖孔、肛侧板、肛沟、基节等具有形态学鉴定意义的部位进行观察对比并拍摄图片。

1.2.2 蜱虫DNA提取 从上述形态学鉴定结果中随机挑选不同蜱虫种类的蜱虫各4只，依次用乙醇浓度为700、500、300、100 mL/L的乙醇溶液在恒温培养摇床中摇床冲洗1 h，再使用高压蒸汽灭菌蒸馏水反复冲洗，经干燥冷冻后利用RETSCH MM400混合冷冻混合球磨仪，将蜱虫磨碎，利用CTAB法提取蜱基因组DNA，置于-20℃保存备用。

1.2.3 蜱虫 16S rDNA基因扩增 参照蜱虫线粒体16S rDNA基因特异性引物[15]，上游引物：5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3′，下游引物5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′，目的片段大小为460 bp，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR扩增反应体系为25 μL：2 × EcoTaqPCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，补dd H2O至25 μL，混匀后进行PCR反应。PCR扩增程序为：94℃ 5 min；92℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 30 s,循环35次；72℃ 8 min。PCR扩增结束后，分别向PCR产物中加入3 μL 6×Loading buffer，并对扩增产物用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，使用G:BOX EF凝胶成像分析仪观察试验结果并拍照记录。

1.2.4 遗传进化分析 委托生工生物工程(上海)股份有限公司对PCR产物(460 bp)进行正向测序。将所测得序列在NCBI数据库中进行Blast搜索，应用序列分析软件DNAstar进行同源性对比分析，应用MEGA7软件，采用邻接算法(Neighbor-Joining，NJ)构建遗传进化树分析。

2 结果

2.1 蜱虫形态学鉴定

本试验共调查乌鲁木齐市1 054只犬，在240只犬体表带蜱，共采集到蜱虫889只，通过形态学鉴定方法，共获得1科1属2种蜱，分别是扇头蜱属Rhipicephalus的血红扇头蜱(R.sanguineus)和图兰扇头蜱(R.turanicus)(表1)。

表1 乌鲁木齐犬体表蜱虫种类及组成Table 1 Species and composition of ticks on the surface of dogs in Urumqi

2.1.1 血红扇头蜱

(1)雄蜱：虫体长约1.9 mm～3.8 mm，呈红褐色卵圆形；假头基呈六角形，宽稍大于长，侧角发达，基突明显呈小尖齿状，后缘微凹向上呈半弧形，须肢宽粗短；盾板呈长卵形，前端较窄后端宽钝，分布有粗细不等的刻点，肩突钝圆，眼不明显，颈沟深而短，侧沟深而细长，自眼后起与第1缘垛相连(图1A)；肛侧板上段直细窄，下段后缘呈圆弧形，后缘较宽无齿突；缘垛明显，中垛常大于旁边缘垛，部分虫体有尾突；基节Ⅰ外距常略短于内距，长而直；基节Ⅱ～Ⅳ各有一外距呈短齿状按节序依次渐小；基节Ⅱ、Ⅲ后内角较窄钝；基节Ⅳ后内角侧有一短突(图1B)；气门扳长逗点形，基部较宽圆，背突逐渐变窄直达盾板背缘(图1C)；除跗节Ⅰ外，跗节Ⅱ～Ⅳ腹缘末端和亚末端均有小齿(图1D)。

(2)雌蜱：虫体长约2.0 mm～3.8 mm，呈卵圆形；假头基呈六角形，宽大稍于长，侧角发达，基突宽钝后缘较平直，孔区小，卵圆形，须肢粗短；盾扳长略胜于宽，呈红褐色，后侧缘似微波纹，眼大呈卵圆形突出，于盾扳最宽处；颈沟前端深向后呈八字分开，约到盾板中后部，侧沟深长达盾板后侧；(图1E)；基节Ⅰ外距长而直短于内距；基节Ⅱ～Ⅳ外距短钝，依次减小；基节Ⅱ、Ⅲ后内角窄钝，基节Ⅳ内角有一短突(图1F)；跗节Ⅱ～Ⅳ腹缘末端和亚末端有小齿。气门扳呈逗点形长大于宽，背突短后缘略凸出(图1G)；跗节Ⅰ无；爪垫较小，近达爪长之半(图1H)。

2.1.2 图兰扇头蜱

(1)雄蜱：虫体长约1.9 mm～3.5 mm，呈卵圆形褐色，盾板卵圆形，前部较窄，后部圆钝，两侧稍突出，表面遍布较多细刻点；颈沟短而深陷，眼椭圆形靠侧缘；侧沟窄长明显，自眼后延伸至第2个缘垛(图2A)；须肢粗短；假头基六角形，宽稍大于长，测角圆突，后缘向上微凹；基突较宽大(图2C)；基节Ⅰ外距比内距稍长或相等；基节Ⅱ～Ⅳ外距较小，呈齿状逐渐变小；基节Ⅱ内距呈脊状，基节Ⅲ无内距，基节Ⅳ有明显的小齿状内距；肛侧板窄长，外缘近于垂直，下段明显向内倾斜，内缘中下部有浅凹，下方有一明显齿突；副肛侧板短小，呈锥状，中垛大于边垛，有尾突颜色较浅(图2B)；气门扳近长椭圆形，背突宽短，且急剧弯曲，末端呈截形或圆钝(图2D)。

(2)雌蜱：虫体长约2.0 mm～3.5 mm，呈卵圆形，盾板长胜于宽，近卵圆形，后侧缘微波状，户端圆钝凸出，呈赤褐色带亮光，眼大呈椭圆形，略微凸起(图2E)；假头基宽短，侧角明显钝凸，基突短钝，后缘较平直(图2G)；基节Ⅰ外距比内距长偶尔相等，基节Ⅱ～Ⅳ各具齿状外距逐渐减小；内距皆无(图2F)；气门扳近逗点形，长稍微大于宽，背突粗短，末端圆钝(图2H)。

A.背面观♂(15×)；B.腹面观♂(15×)；C.气门扳♂(90×)；D.跗节Ⅳ♂(70×)；E.背面观♀(18×)；F.腹面观♀(55×)；G.气门扳♀(129×)；H.跗节Ⅳ♀(60×)A.Dorsal view♂(15×);B.Ventral view♂(15×);C.Peritreme♂(90×);D.Tarsus Ⅳ♂(70×);E.Dorsal view♀(18×);F.Ventral view♀(55×);G.Peritreme♀(129×);H.Tarsus Ⅳ♀(60×)图1 血红扇头蜱形态学鉴定结果Fig.1 Morphological identification of R.sanguineus

A.背面观♂(16×)；B.腹面观♂(16×)；C.假头基背面♂(85×)；D.气门扳♂(95×)；E.背面观♀(15×)；F.腹面观♀(15×)；G.假头基背面♀(70×)；H.气门扳♀(100×)A.Dorsal view♂(16×);B.Ventral view♂(16×);C.Capitulum dorsal♂(85×);D.Peritreme♂(95×);E.Dorsal view♀(16×);F.Ventral view♀(16×);G.Capitulum dorsal♀(70×);H.Peritreme♀(100×)图2 图兰扇头蜱形态学鉴定结果Fig.2 Morphological identification of R.turanicus

2.2 分子生物学鉴定

2.2.1 16S rDNA PCR扩增结果 利用PCR方法扩增蜱虫线粒体16S rDNA特异性基因片段，PCR产物经15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，在460 bp左右出现目的条带，与目标条带大小相符(图3)。

M.DNA标准DL 2 000；1～4.检测样本；“-”阴性

2.2.2 遗传进化分析 将所得PCR产物测序结果经Blast比对分析，结果表明，所采集的蜱虫分别为血红扇头蜱和图兰扇头蜱。用MEGA7软件对经Blast比对得到的数据库中的血红扇头蜱和图兰扇头蜱分别构建系统进化树，发现本地区采集的4条血红扇头蜱16S rDNA序列独立的形成一个分支；本地采集的图兰扇头蜱与已知的新疆的图兰扇头蜱在一个分支上，具有很高的同源性(图4)。

图4 基于16S rDNA基因的蜱系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of ticks based on 16S rDNA genes

3 讨论

本试验于2020年3至6月对乌鲁木齐市共1 054只犬感染蜱虫的情况进行调查，发现在240只犬的体表有蜱虫寄生。共采集到889只蜱。在蜱虫样本收集过程中发现，从3月底开始少部分犬体表出现少量蜱虫，4月中旬大量暴发一直持续至6月初开始慢慢减少，6月中旬大量减少，6月底极少。这与已发表的文献[15,18]新疆地区采集蜱虫时间及活动高峰相似。

形态学鉴定发现，鉴定要点为血红扇头蜱跗节Ⅱ～Ⅳ腹缘末端和亚末端均有小齿，肛侧板后缘呈圆弧形较宽无齿突;图兰扇头蜱有一颜色稍浅于盾板的尾突，肛侧板内缘浅凹处有一明显齿突，部分血红扇头蜱与图兰扇头蜱形态相似。所以对蜱种准确的鉴定不能单纯依靠传统的形态学方法，应该结合分子生物学技术对同种蜱类进行系统发育研究。本试验在形态学鉴定的基础上，结合蜱类线粒体16S rDNA对蜱进行鉴定，进一步验证了形态学鉴定的结果。试验结果表明新疆乌鲁木齐市犬体表主要寄生的蜱虫种类主要为血红扇头蜱和图兰扇头蜱，遗传进化分析发现新疆乌鲁木齐市的血红扇头蜱与中国境内河北地区的血红扇头蜱具有较高的同源性，序列P115与P112、P23、P104处于不同的遗传进化分支；图兰扇头蜱与中国境内河北地区与新疆的图兰扇头蜱均有较高的同源性，P118与P7、P114、P116处于不同的遗传进化分支，均与国外报道的蜱虫16S rDNA基因有较大的差异，说明血红扇头蜱和图兰扇头蜱均具有遗传进化的保守性。此次发现的乌鲁木齐市犬体表寄生的血红扇头蜱及图兰扇头蜱优势度相当，由于蜱传播病原体一般与蜱种之间存在着一定的对应关系，亲缘关系越近的蜱种，其传播相同病原体的机会越大，已知血红扇头蜱为犬巴贝斯虫的传播媒介[14]，此发现有待于今后对乌鲁木齐及周边地区犬蜱、蜱传犬巴贝斯虫病及蜱传人畜共患疾病进一步深入研究。