一种牛源扇头蜱及其携带梨形虫种类鉴定

尹传松，缑静敏，栾宇轩，马 丽，王婉泽，要慧中，杜嘉玥,3，陈韬凝，刘光远，林 青,2,3*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜动物疫病国家重点实验室，甘肃兰州 730046；3.西北农林科大学动物医院，陕西西安 710068)

蜱(tick)是一种吸血性节肢动物，作为一种体外寄生虫，会吸食人和多种动物的血液，并可通过吸血途径传播包括病毒、细菌、原虫等多种病原体[1]。我国蜱种的多样性较高，截至2013年国内共发现蜱类119种，约占全球已鉴定蜱种总数的13.7%[2]。2019年，我国已报道蜱虫125种，其中硬蜱111种、软蜱14种[3]。硬蜱是多种病原体的载体，给畜牧业及公共卫生带来很大危害，甚至引发人畜共患病[4]。蜱传疾病对于全球的威胁正在增加，新的病原体不断被发现[5]。自1982年以来，共报道了33种新发蜱媒病原体，这些病原体是由近30种不同蜱种传播的[6]，其中包括8种斑点热群立克次体、6种莱姆病螺旋体基因群、11种巴贝斯虫、1种发热伴血小板减少综合征病毒以及无形体科中的3种埃立克体、3种无形体和1种新立克次体。在新发现的33种蜱媒病原体中，有15种能引起人类感染[6]。

梨形虫病(Piroplasmosis)在世界范围内流行，给畜牧业造成巨大损失。该病的病原体是梨形虫目(Piroplasmida)、巴贝斯科(Babesiidae)的巴贝斯属(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)的泰勒属(Theileria)的原虫，分别引起巴贝斯虫病(Babesiosis)和泰勒虫病(Theileriosis)，它们是重要的蜱传寄生原虫，其中许多种类对牛、绵羊、山羊和人具有高致病性[7]。本研究对采自汉中市的牛源蜱虫进行鉴定，对其所携带梨形虫病原(巴贝斯虫、泰勒虫)的种类进行分子鉴定，为后续开展蜱类研究以及当地蜱传梨形虫病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 蜱虫样品 2020年4月至10月在陕西省汉中市采集牛体表寄生蜱共67只，将所有采集到的蜱分别装入采集管，做好标记与编号，带回实验室用去离子水反复冲洗干净，然后将其置于750 mL/L的酒精中保存于4℃冰箱备用。

1.1.2 主要试剂 节肢动物基因组DNA提取试剂盒，OMEGA Bio-Tek(广州)公司；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、6×loading buffer、DNA 标准2 000、溴化乙锭等,宝日医生物技术有限公司；TaqDNA Polymerase、10×PCR buffer,康为世纪公司；无水乙醇等其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 普通光学显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；体视显微镜，上海普赫光电科技有限公司；高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；PCR仪，杭州博日科技有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；全自动紫外凝胶成像分析系统，北京赛智创业科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蜱的形态学初步鉴定 用体视显微镜与普通光学显微镜，对所采集到蜱的假头基、背面、腹面、盾板、足基节、须肢、生殖孔、肛门、肛沟等特征进行形态学观察，并参照文献[8]对蜱的种类进行初步鉴定。

1.2.2 蜱基因组DNA提取 将所有采集到的蜱使用节肢动物基因组DNA提取试剂盒提取蜱基因组DNA，提取到的蜱基因组DNA在-20℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增与测序 利用线粒体16S rDNA的通用引物对蜱进行分子鉴定，参照文献[9]所用的引物：上游引物为F(5′-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTG-3′)，下游引物为R(5′-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3′)。PCR反应体系为25 μL：灭菌双蒸水16.375 μL，10×PCR buffer(15 mmol/L Mg2+)2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物各1 μL，TaqDNA polymerase(5 U/μL)0.125 μL，DNA样品2 μL。反应参数：94℃ 5 min；94℃ 40 s，50℃ 40 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃ 10 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增出目的条带的产物送往北京擎科生物科技有限公司测序。

1.2.4 蜱携带梨形虫种类的分子检测 基于梨形虫18S rRNA基因(430 bp)，采用套式PCR方法对蜱可能携带的梨形虫种类进行分子检测，检测所用的引物参照文献[10-11](表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 扩增梨形虫18S rRNA的引物信息Table 1 Primer information of 18S rRNA amplification of Piroplasma

套式PCR扩增的第1轮使用引物对RIB-19/RIB-20，第2轮使用引物对BAB-F/BAB-R，且第2轮扩增的DNA模板为第1轮PCR的产物。两轮PCR反应参数一致：94℃ 5 min；92℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min，35个循环；72℃ 8 min。PCR的反应体系与扩增蜱虫基因组的反应体系一致。扩增的阳性产物送往北京擎科生物科技有限公司测序。

1.2.5 序列比对与遗传进化分析 将测序结果与NCBI网站GenBank中的参考序列进行比对，使用MEGA-X软件对蜱16S rDNA基因、梨形虫18S rRNA基因分别进行种系发育分析，使用邻接法，设置Bootstrap的复制数为1000，采用Kimura 2-parameter模型分别构建系统发育树，进一步确定蜱的种类和蜱携带病原梨形虫的种类。分析蜱16S rDNA基因时选择的参考序列为微小扇头蜱(R.microplus)(JX051062、KP210054、MK495912、KC170742、MF351562)，并以新疆草原革蜱(Dermacentornuttalli)(KC203345)、山东长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)(KC203360)和埃及血红扇头蜱(R.sanguineus)(MF946468)的序列作为外群。而分析梨形虫18S rRNA基因时选择的参考序列为东方泰勒虫(T.orientails)序列(MH208640、AY661513、KX965721、AF081137、KT124538、MG757649)、牛巴贝斯虫(B.bovis)序列(KY805832、HQ264127、JX274283)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)序列(KY805829、EF458196、MN053036)，并以环形泰勒虫(T.annulata)(LC547980)和卵形巴贝斯虫(B.ovata)(KX870098)的序列作为外群。

2 结果

2.1 蜱种类的鉴定结果

2.1.1 蜱的形态学观察结果 形态学观察结果显示，样本中的雌蜱假头宽胜于长，假头基呈六角形，基突粗短；盾板长胜于宽，略呈五边形，气门板长圆形，足长中等；雄蜱假头短，假头基六角形，基突短，呈三角形；盾板较窄，未完全覆盖躯体两侧，颈沟浅而宽，后中沟较宽而深。综合以上特征，初步鉴定67只样本蜱均属于微小扇头蜱(R.microplus)。

2.1.2 蜱的16S rDNA PCR扩增与测序结果 基于蜱线粒体16S rDNA基因进行PCR扩增并测序，扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，得到460 bp左右的核酸片段，与预期片段大小相符(图1)。将测序得的序列在NCBI网站进行Blast序列比对，结果显示67个样本蜱的16S rDNA基因序列与已知的微小扇头蜱(R.microplus)的序列相似性为99.3%。

M.DNA标准DL 2 000；1～8.蜱虫样品；N.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000;1-8.Tick samples;N.Negative control图1 部分蜱16S rDNA序列片段的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of 16S rDNA sequences in ticks

2.1.3 蜱的系统发育分析 通过对67只蜱16S rDNA基因的扩增与测序，选择部分代表性样品序列进行种系发育关系的构建(图2)。代表性样本tick1、tick17、tick22和tick43等均与已知的微小扇头蜱(R.microplus)(JX051062、KP210054、MK495912、KC170742、MF351562)序列聚集在一起形成一个大的分支，相似性为97.11%～99.51%，同属于微小扇头蜱。外群新疆草原革蜱(Dermacentornuttalli)(KC203345)、山东长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)(KC203360)和埃及血红扇头蜱(R.sanguineus)(MF946468)形成独立的分支，相互之间的亲缘关系较远。综上经形态学初步观察、序列相似性比对以及系统发育分析等综合鉴定，确定本次所采集的67只牛源蜱虫均为微小扇头蜱。

每个节点分支上的数字表示自展值，本研究中的序列用圆形(●)标记 The number on each node branch represents the bootstrap value，The sequences in this study are labeled with circles图2 基于蜱16S rDNA基因的蜱种系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic trees of tick species based on 16S rDNA gene

2.2 蜱携带梨形虫的检测结果

2.2.1 梨形虫18S rRNA PCR扩增及测序结果 用套式PCR扩增梨形虫18S rRNA基因片段，经过10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品出现约430 bp左右的目的条带(图3)。

M.DNA标准DL 2 000；1～6.蜱虫样品；N.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000;1-6.Tick samples;N.Negative control图3 梨形虫18S rRNA基因套式PCR扩增结果Fig.3 Nest PCR amplification results of Piroplasma 18S rRNA

通过PCR扩增与测序比对，结果显示，在67只样本蜱中有35只检测出了梨形虫，阳性率为52.2%。其中，在1只蜱中检测到牛巴贝斯虫，在2只蜱中检测到双芽巴贝斯虫，在32只蜱中检测到东方泰勒虫，3种梨形虫的阳性率分别为1.5%、3.0%和47.7%，本次未检出有3种病原混合感染的情况。

2.2.2 梨形虫的遗传特征分析 基于梨形虫18S rRNA基因序列，选择本研究具有代表性的序列与参考序列构建系统发育进化树(图4)。本研究所检测到的代表性序列 tick12、tick39、tick40、tick44等与GenBank数据库中的东方泰勒虫(T.orientails)参考序列(MH208640、AY661513、KX965721、AF081137、KT124538、MG757649)聚集在一起形成第1个分支，相似性为98.77%～99.26%。第2个分支为 tick 1的序列与牛巴贝斯虫(B.bovis)参考序列(KY805832、HQ264127、JX274283)聚集在一起，相似性为98.21%～98.47%。第3个分支为 tick 38、tick47的序列与GenBank数据库中的双芽巴贝斯虫(B.bigemina)参考序列(KY805829、EF458196、MN053036)聚集在一起，相似性为99.49%～99.74%，以上3个分支与环形泰勒虫(T.annulata)参考序列(LC547980)以及卵形巴贝斯虫(B.ovata)参考序列(KX870098)均形成不同的分支它们之间的亲缘关系较远。

"●"表示本研究中的样本序列Sign"●"on behalf of the sample sequences in the present study图4 基于梨形虫18S rRNA基因的系统发育树Fig.4 Phylogenetic trees based on Piroplasma 18S rRNA gene

3 讨论

陕西省蜱的种类丰富多样，不同区域有微小扇头蜱(R.microplus)、长角血蜱(H.longicornis)、锐跗硬蜱(Ixodesacutitarsus)等26种蜱均有分布[12]。本次从汉中市牛体表采集到的蜱经过形态学观察与分子生物学鉴定，并利用16S rDNA基因扩增出的序列构建系统发育进化树分析，结果67只样本蜱全部鉴定为微小扇头蜱，表明在汉中市牛体表寄生的硬蜱优势种为微小扇头蜱。

本次检测到梨形虫的阳性率高达52.2%，涉及到牛巴贝斯虫(B.bovis)、双芽巴贝斯虫(B.bigemina)和东方泰勒虫(T.orientails)共3个种类。巴贝斯虫是一种通过蜱传播的在红细胞内寄生的血液原虫，可感染野生和家养动物[13]。牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫是巴西大部分地区流行的地方病，对畜牧业可造成巨大的经济损失，其中微小扇头蜱是唯一的传播媒介[14]。本研究中，微小扇头蜱携带牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和东方泰勒虫的阳性率分别为1.5%、3.0%和47.7%，由此可知，汉中市牛源微小扇头蜱感染的梨形虫种类主要以东方泰勒虫为主。东方泰勒虫是经蜱传播后可引起牛科动物发生东方泰勒虫病的病原，东方泰勒虫病分布在世界各地[15]。东方泰勒虫可能会通过微小扇头蜱进行传播，应该采取措施来消除微小扇头蜱的滋生，并注意在其分布区域内重点对东方泰勒虫病的防控。