山羊海藻百伯史坦菌分离鉴定与药敏试验

李梦磊，刘广阔，蒲 鹏，张 琪，高 睿，许信刚*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.杨凌职业技术学院动物工程分院，陕西杨凌 712100)

山羊海藻百伯史坦菌(Bibersteiniatrehalosi)属于巴氏杆菌科、比伯斯坦杆菌属成员[1]，本菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，主要引起羊呼吸系统疾病，还与羔羊的全身感染有关，严重时可致羊死亡。发病羊临床表现为发热、呼吸急促、反复咳嗽、眼鼻常有分泌物、腹泻、脱水和食欲不振等[2]。国外已经有山羊海藻百伯史坦菌感染动物的相关报道，但国内研究较少。2007年从1例脑脓肿患者头部分离出山羊海藻百伯史坦菌[3]。2018年从病死羔羊肺脏中分离到山羊海藻百伯史坦菌[4]，这是国内首例从动物体内分离到该菌，同年在犊牛肺脏出也分离到该菌[5]。该菌对羊呼吸道具有极强的致病力，因此，对于该菌引起疾病的防控与诊断很重要。2021年3月，陕西省某奶山羊场发生了奶山羊肺炎，其主要症状为食欲减少、精神不振、咳嗽、流鼻涕、食欲废绝，起卧不安甚至出现部分羊只死亡。为找出发病原因并为治疗提供依据，本文对病死羊的肺脏进行病原微生物的分离鉴定，并对分离菌进行药敏试验，用筛选出的敏感药物对病羊肌肉注射治疗后，羊群肺炎疫情很快得到控制并治愈。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 无菌从陕西省某奶山羊场发生肺炎的病死羊中取出肺脏和肝脏的病料，置于放有冰袋的保温箱中送实验室。

1.1.2 培养基 血液琼脂平板、普通琼脂平板、半固体糖发酵培养基等，按照文献[6]的方法制备。

1.1.3 试剂 MR试剂、VP试剂、革兰氏染液等按照文献[6]的方法制备；药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.4 主要仪器设备 隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；PCR基因扩增仪，力康生物医疗科技控股有限公司；凝胶成像分析系统，北京赛智创业科技有限公司。

1.1.5 实验动物 健康昆明小鼠10只，体重30 g左右，购自空军大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 将无菌采集的肺脏和肝脏病料分成两部分，一部分病料划线分离接种到鲜血琼脂平板上，将平板置于37℃培养箱中培养24 h后，挑取优势单菌落进行革兰氏染色镜检，若为纯培养物，进一步划线分离于鲜血琼脂平板上进行纯培养。另一部分病料置于加无菌石蜡油的肝块肉汤中进行厌氧培养。

1.2.2 分离菌形态观察、鉴定及药敏试验 挑取分离纯化后的单菌落按照文献[6]方法进行形态结构与染色特性观察。根据文献[7]相关研究进行糖分解试验、VP、MR试验等。按照文献[8]介绍的纸片扩散法操作判定分离菌的耐药性。

1.2.3 16S rRNA基因序列测定 细菌采用水煮法提取DNA，选用16S rRNA通用引物，上游引物为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG下游引物为：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反应体系20 μL：模板DNA 2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、Mix 10 μL，其余用ddH2O补足，按照以下程序进行PCR扩增：95℃ 10 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃延伸10 min。目的片段约为1 500 bp。PCR阳性产物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行16S rRNA基因测序。将测序结果上传NCBI官网进行序列比对确定分离株种类。

1.2.4 小鼠致病性试验 将分离株单个菌落接种到肉汤培养基中，37℃恒温培养24 h后，用平板计数法测定细菌浓度，用灭菌的生理盐水将菌液稀释至浓度1×108CFU/mL，备用。将10只健康昆明系小鼠随机分成两组，一组为试验组，腹腔注射菌液0.2 mL/只；另外一组为对照组，腹腔注射肉汤0.2 mL/只。在合适的饲养条件下每日观察小鼠状态。

2 结果

2.1 细菌分离与染色结果

肝脏和肺脏中各分离到1株菌，该分离株在鲜血平板上于37℃培养过夜后，有淡黄色中等大小菌落生长，菌落表面光滑、边缘整齐。挑取单菌落进行革兰氏染色镜检后，结果显示为革兰氏阴性杆菌(图1)，形态学观察显示，肝脏和肺脏中分离到的2株细菌形态一致。厌氧培养基也有细菌生长，镜检显示为革兰氏阴性杆菌与鲜血平板上所生长菌相似。

图1 菌株染色镜检结果Fig.1 Results of microscopic examination of strain staining

2.2 生化特性

该分离菌能分解海藻糖、葡萄糖、乳糖、甘露糖以及蔗糖，不分解半乳糖、山梨糖与鼠李糖；VP、MR试验为阴性(表1)。这2株菌生化特性相同，初步鉴定为同属于一种细菌，其生化特性与山羊海藻百伯史坦菌相符。

表1 分离株生化试验结果Table 1 Biochemical test results of isolates

2.3 药敏试验结果

筛选临床常用10种药物进行药敏试验，结果显示该菌对丁胺卡那高度敏感，对多黏菌素B中度敏感(表2)。

表2 分离株药敏试验结果Table 2 Results of drug sensitivity test of isolates

2.4 16S rRNA基因序列测定结果

将2株分离菌株分别进行16S rRNA PCR扩增，扩增产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI官网进行Blast序列比对。结果显示，2株分离菌株与山羊海藻百伯史坦菌序列同源性高达98%，可确定2株分离株为同一种菌，均为山羊海藻百伯史坦菌。

M.DNA标准DL 2 000；1.菌株1；2.菌株2M.DNA Marker DL 2 000；1.Strain 1；2.Strain 2图2 菌株16S rRNA PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of 16S rRNA of strains

2.5 小鼠致病性试验

将分离株菌液注射到小鼠腹腔使小鼠感染后，24 h试验组小鼠开始出现精神沉郁、行动迟缓等症状，2 d后感染组小鼠开始出现死亡，取死亡小鼠进行无菌剖检，发现小鼠肺脏边缘点状出血，肝脏有很多灰色病灶。分别将肝脏、肺脏进行涂片镜检与分离培养PCR鉴定，镜检发现革兰氏阴性球杆菌。结果显示，致使小鼠死亡的病原菌为注射所用的山羊海藻百伯史坦菌。对照组小鼠未见有异常情况。

3 讨论

山羊海藻百伯史坦菌作为一种人畜共患病原菌，是导致大角羊暴发流行性肺炎的重要病原体，极大的降低了大角羊的存活率和种群数量[5,9]。现阶段国内虽然发病较少，但随着经济全球化的不断发展，我国的对外贸易也日益频繁，该菌对我国畜牧养殖业和社会公共卫生带来一定的安全隐患。因此，对于山羊海藻百伯史坦菌的防控工作也变得日益重要。本试验从有明显呼吸道症状的病羊肺脏中分离得到分离株，通过传统的生化试验以及16S rRNA测序比对结果，确定该分离株为山羊海藻百伯史坦菌，证实了山羊海藻百伯史坦菌可以感染羊，并由此推断山羊海藻百伯史坦菌的感染在我国已经逐渐成为引起羊呼吸道疾病的一种新的病原菌。尽管我国对于山羊海藻百伯史坦菌的报道较少，但是药敏试验表明，该菌已经对多种抗生素产生了耐药性。目前国内外还没有研发出有效的单价疫苗来专门预防山羊海藻百伯史坦菌引起的感染[10]，所以对于该菌引起的呼吸道疾病还有很多问题亟待解决，对于该菌的致病机制、传播机理以及疫苗研发等方面的进一步研究日趋紧迫。本次由山羊海藻百伯史坦菌引起的山羊肺炎，选用丁胺卡那能够有效治愈。本研究的意义在于对于山羊海藻百伯史坦菌的感染可以及时发现，合理选用敏感药物以此来挽救养殖场的损失，并对于以后研究其耐药机制、选用抗菌药物提供合理依据，对防控和治疗此类病原菌引起的山羊呼吸道疾病具有重要意义。