病原微生物检验技术研究进展

唐尹勤

关键词：病原微生物;检验技术;综述

【中图分类号】Q93 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2022）08--01

一切可以导致疾病发生的病原体都称为病原微生物，其在宿主中进行生长繁殖、释放毒性物质等，可引起机体不同程度的病理变化，引起感染甚至传染病。微生物感染性疾病在临床治疗中，均需进行微生物检验，以明确病原微生物类型，再通过病原微生物耐药性检测，以便及时指导抗感染治疗[1]。因此微生物检验技术已成为临床治疗中比较重要的工作。传统的微生物检验法（细菌分离、培养及生化反应）速度比较慢，投入的人力物力比较大，难以适应诊断与治疗，不能满足临床诊断及流行病学研究[2]。随着免疫学、生物化学、分子生物学及计算机技术的不断发展，微生物检验新技术已被推广，提高其诊断水平。本文就病原微生物检验技术研究进展进行综述。

1 微生物快速检验技术

传统微生物检测需要细菌培养才能获得结果，具有耗时、费力、操作难度高的特点，且对检测人员的技术要求较为严格，稍有失误，就会影响检测结果的准确性。该种方法因细菌培养及繁殖时间较长，拉长了检测周期，致使疾病的治疗和防控工作无法满足[3]。而微生物快速检验技术能够弥补传统微生物检验法的不足，可以提升临床诊断的可靠性、时效性。

1.1显色培养基技术

微生物在自身新陈代谢过程中产生的酶能够与显色底物发生反应，继而显示颜色，根据这一原理，出现了显色培养基这一微生物快速检验，以完成微生物的筛选分离，主要用于金黄色葡萄球菌、霉菌、酵母菌、大肠菌群等微生物[4-5]。显色培养基可使得目标微生物显色明显，有助于检测人员根据显色结果快速分析和判断。根据显色培养基的原理，经过改进，最终成为快速检测纸片法[6]。

1.2基因探诊技术

基因探诊技术又称分子杂交技术，通过标记特定DNA片段，使得待测单链核酸分子与DNA分子形成双链核酸分子，快速识别目标微生物。在基因探诊技术的基础上，形成基因芯片技术，预设DNA排列方式（微量点样手段），在样本分析、基因探针杂交方式，获得微生物靶基因、含量等信息，进而快速、准确的确定病原微生物[7]。

1.3聚合酶链式技术

聚合酶链式（polymerase chain reaction，PCR）是特定条件，特定DNA片段，快速扩增处理（体外酶促反应），监测特异性扩增产物，实现快速检测[8]。此外在PCR技术基础上，产生定时定量PCR技术、多重PCR技术、PCR变形梯度凝胶电泳技术、PCR高分辨溶解曲线分析技术等。

1.4微生物自动化鉴定技术

微生物自动化鉴定技术是一项具有自动化特征的细菌培养鉴定技术，主要包括全自动微生物鉴定专家系统、全自动血液细菌培养仪。全自动微生物鉴定专家系统能够实现全自动化检测，不仅能够保证检测准确性，还能够提升检测速度[9]。全自动血液细菌培养仪基本上实现了全过程自动化检测，在标本收入培养瓶后，放入仪器，配合荧光检测器，如此就可自动完成培养、动态检测。

1.5免疫学实验技术

免疫学实验技术包括免疫酶技术、荧光免疫技术。免疫酶技术中运用最为广泛的是酶联免疫吸附试验（enayme liked immunosorbent assay，ELISA），其主要是通过酶的催化作用转化物质，将酶定位标记物，观察酶催化底物的颜色反应，得到抗原抗体反应。荧光免疫技术是利用免疫学技术结合荧光标记（荧光素视为标记物），荧光显微镜观察标本，确定抗原/抗体的基本情况[10]。

2 单细胞拉曼技术

单细胞拉曼技术可用于揭示物质本质，基于拉曼光谱分析原理，实现非培养、无标签、快速、高效、低成本的新方法。单细胞拉曼技术应用于病原微生物检测中，其原理是在已建立的微生物拉曼图谱库基础上，结合拉曼分析软件和不同分析方法对病原微生物进行鉴定;检测内容包括：培养后鉴定细菌、真菌、分枝杆菌，直接鉴定原始样本（透析液、尿液、血液;“指纹图谱”行原位检测病原微生物种类），生物膜检测葡萄球菌，高度同源分枝杆菌鉴定（“指纹图谱”差异峰区分）;优势是快速、非培养、无破坏性实现原位标本检测和难鉴定菌株准确区分;不足是需要建立数据库和专业分析软件[11]。

近年来，单细胞拉曼技术朝着自动化、智能化、高通量方向发展，结合自动收集目标细胞装置，形成单细胞拉曼分选技术平台，应用于病原微生物自动化检测中，其原理是将预处理样本实现单个细胞流动至SRCS区（经微流控芯片），行快速拉曼光谱检测，分选出目标细胞（信息系统控制下的细胞分选系统），进行分子生物学检测;具有筛选自动、高效、准确的活性细胞优势，但需特定的仪器和分析系统，且价格昂贵，检测内容主要包括：筛选高通量自动化目标微生物、检测“肠道微生态”[12]。

目前大量广谱数据分析和数据模型的建立仍需依赖专业的生物信息团队，近年来，涌现出了广谱分析软件和数据库，预示着智能化、便捷分析方法时代的来临，但单细胞拉曼技术各项操作的标准有待建立，标本前期处理、参数设置的差异限制了该技术的标准化。

3 基于纳米技术的病原微生物核酸快速检测

核酸是病原微生物体内重要的遗传物质，检测核酸可快速诊断感染病原微生物类型。纳米材料具有特殊的光、電、热、磁等，结合核酸检测技术，可提高检测速度。

3.1基于纳米孔的单分子测序技术

纳米孔由生物或聚合物材料制成，纳米尺寸效应在测序（核酸检测）中发挥重要作用。纳米孔技术实现测序的方法是：核酸分子通过纳米孔时产生的电信号变化，是一种新型的无标记、无扩增技术，具有通量高、速度快、成本低、检测序列长的优点，适用于现场检测。Joshua Quick[13]等使用纳米孔对埃博拉病毒行DNA检测，1小时即可完成序列测定，可在有限条件下实时监测病毒，还可用于沙门菌、溶血性巴氏杆菌的检测。生物纳米孔的稳定性、持久性较差，限制了纳米孔的发展，而固态纳米孔（纳米材料：氮化硅、石墨烯）在稳定性具有明显优势，降低背景信号对检测结果的影响。

3.2基于纳米材料的核酸扩增检测技术

3.2.1环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是一种核酸扩增技术，利用聚合酶在等温条件下扩增靶序列，放大信号，但存在结果判读难的问题。为了解决上述问题，Orapan Manajit等[14]将金纳米颗粒（AuNPs）与LAMP结合，实现铜绿假单胞菌的高效检测。AuNPs与靶DNA互补杂交，抑制AuNPs因静电作用而在盐溶液中发生聚集现象，提高DNA-AuNPs的稳定性，使溶液仍呈红色（聚集时由红色变为蓝色或透明），便于结果判读。基于LAMP技术，出现了逆转录环介导等温扩增（Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP），用于布尼亚病毒、流感病毒等RNA检测，但受实验室仪器设备的限制，不适合现场检测、多重复合扩增检测。通过直接观察待测液呈红色，则判为阳性反应，使得RT-LAMP无需使用凝胶电泳或实施浊度仪，即可判读结果，实现现场检测。

3.2.2 链置换扩增技术

链置换扩增技术（strand displacement amplification，SDA）是一种核酸等温扩增技术，基于酶促反应，主要利用限制性内切酶切割识别位点的核酸，聚合酶在切口处向下延伸，置换下游序列能力，扩增核酸序列（等温条件），进行核酸检测，但也需要特殊仪器。为了解决这一难题，Hongxing Liu等[15]将AuNPs与硫醇化后的RNA耦联形成探诊，实现可视化检测，改良后的SDA技术，可检测李斯特菌RNA，提高了传统SDA的灵敏度和特异性。

3.2.3重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶擴增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种恒温扩增新技术，由重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换Bsu聚合酶参与，其可在较短时间和较低温度条件下将核酸分子扩增到可检测水平。RPA技术的产物主要运用侧向流动技术（LF）读取，因其标记物AuNPs具有独特的光学性质，标记目标容易可视化，可直接肉眼观察，广泛应用于微生物检测中。但实际应用中，纳米材料存在易于团聚、批间差异性大、生物安全性有待提高等问题，限制了其在核酸检测中的应用，因此未来应加强纳米材料在等温技术中的应用，进一步优化现有技术。

4 总结

近年来，病原微生物造成的感染性疾病发病率逐年升高，严重威胁人们的身体健康，因此对病原微生物进行早期检测，是感染性疾病的防控关键。传统病原微生物检测主要包括细菌培养、生化鉴定等，但所需时间长，对操作人员要求高，已出现“窗口期”而导致假阴性结果。而微生物快速检验技术、单细胞拉曼技术、基于纳米技术的病原微生物核酸快速检测均可快速、准确的判定病原微生物类型，从而为感染性疾病的早期诊断和及时治疗提供技术支撑。

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