5-氮胞苷提高‘水晶’葡萄耐铝性的相关机制研究

徐仕琴，陈姣，张永福，莫丽玲

（昆明学院农学与生命科学学院，云南昆明 650214）

地壳中铝的平均含量高达8%，在中性或碱性土壤中，铝以无毒铝硅酸盐的固定态存在，植物难以吸收，不会产生毒害。但由于酸雨导致土壤酸化加剧[1]，铝溶出增加，活性铝数量急剧上升，Al3+转化为离子态析出对植物造成毒害[2]，成为限制作物发育和生产力的主要因素[3]。我国的红壤富含铝，约占总面积的20%[4]，因此研究如何降低铝胁迫对作物的影响意义重大。5-氮胞苷是一种DNA甲基化抑制剂，通过去除甲基化胞嘧啶中的一种甲基，使基因组甲基化水平降低的碱基类似物[5]。DNA甲基化存在一个阈值范围，在此范围内促进植物的生长发育[6]，其中DNA甲基化水平降低是植物应对胁迫的方式之一[7]，能够激活一些基因的表达，增强耐逆境能力[8-9]。5-氮胞苷在作物中的应用已被证明具有新的有益性状，主要集中在生理[10-11]、表型[12]、表观遗传状态的改变[9]，可提高红麻的耐盐性[13]，保护小麦免受盐胁迫[14]。此外，5-氮胞苷还应用于拟南芥在高土壤盐分、热胁迫和干旱胁迫下的研究[15]，关于植物对逆境反应的研究相对较少，5-氮胞苷应用于铝胁迫下生理机制的响应研究目前未见相关报道。

葡萄在酸性土壤中栽培，同其它作物一样面临着铝毒害作用。主要体现在抑制植物体内重要生物学过程，例如破坏细胞膜导致细胞内渗透不平衡、抑制光合作用、活性氧防御系统失衡、膜脂过氧化水平上升等[16]。此外，根系和植株发育受到严重遏制，影响其对水分和养分的吸收[17]，氮磷钾含量减少[18]。因此，在葡萄植株受到铝胁迫时利用5-氮胞苷缓解葡萄在铝毒胁迫下的伤害，为葡萄生产提供一定的理论依据，对葡萄产业发展具有积极作用。本研究以‘水晶’葡萄扦插苗为材料，在Hoagland's营养液中加入硫酸铝后，喷洒不同浓度的5-氮胞苷，35 d后测定各处理植株生长状况、以及营养物质对铝胁迫的应激响应，探讨缓解铝毒害途径，提供一定的抗铝栽培理论依据，促进酸性土壤葡萄产区的发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

挑选来自云南省弥勒市东风农场管理局的欧美杂种‘水晶’葡萄当年生健壮枝条，栽植于25 cm×30 cm营养钵中，每钵栽植1株，每3 d浇500 mL的Hoagland's营养液（pH＝4.8）。

1.2 试验设计

在Hoagland's营养液中加入20 mmol·L-1Al2(SO4)3，与此同时喷洒不同浓度5-氮胞苷，浓度分别为0、100、200、400、800 µmol·L-1，每7 d喷洒1次，以不加硫酸铝不喷洒5-氮胞苷为对照。各处理具体如下：T0：Hoagland's营养液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3；T1：Hoagland's营养液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3＋100 µmol·L-15-氮胞苷；T2：Hoagland's营养液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3＋200 µmol·L-15-氮胞苷；T3：Hoagland's营养液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3＋400 µmol·L-15-氮胞苷；T4：Hoagland's营养液＋20 mmol·L-1Al2(SO4)3＋800 µmol·L-15-氮胞苷；CK：Hoagland's营养液。处理时间为35 d。每隔7 d取成熟、健康、生长均匀一致的叶片，去离子水清洗干净。用烘箱105 ℃杀青10 min后转为95 ℃彻底烘干，研磨成粉末，过80目标准筛，收集筛下的粉末用于测定各项指标。试验重复4次。

1.3 指标测定方法

株高和根长测量用卷尺；茎粗测量用游标卡尺；植株和根的鲜质量测量用电子天平；根系体积测量用排水法。

根冠比（%）＝（地下部分鲜质量÷地上部分鲜质量）×100。

逆境相关指标测定：丙二醛（MDA）采用双组分光光度法[19]；叶绿素、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的测定参照张志良的方法[20]；氮、磷、钾的测定分别采用纳氏试剂显色法、钼蓝法、四苯硼钠法；可溶性糖、淀粉和蛋白质含量测定参照高俊凤[21]；铝含量的测定采用洛天青S显色法。

1.4 数据处理

SPSS 19.0软件进行数据统计分析，Duncan's 新复极差法检验差异显著性（P＜0.05），用Excel作图。

2 结果及分析

2.1 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄形态指标的影响

为了观察5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄植株发育的影响，记录了处理35 d后植株和根系的状态。从图1可看出，与CK相比，T0、T3、T4植株茎叶萎蔫比对照明显，T2植株叶片存在失水现象，其中T1植株未出现异常现象。从图1还可看出，与CK相比，T0、T2、T3、T4根系颜色发黑，须根数目少甚至不长，主根伸长缓慢，T1一定程度抑制了铝胁迫对根系的毒害，表现在根系生长茂盛且根生物量增加。

图1 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄植株和根系的影响Figure 1 Effects of 5-azacуtidine on grape plants and roots under aluminum stress

从表1可看出，与CK相比，T0株高降低6.34%，茎粗增加67.79%，T1的株高比T0的高，且差异达到显著水平；与CK相比，T0的根鲜质量、根体积、根长分别下降12.86%、42.18%、37.31%，根冠比升高32.99%，T1、T2的根鲜质量、根体积高于T0，根冠比低于T0，且达到差异显著性水平；此外T1的根长显著高于T0。可见，在铝胁迫下，不同浓度的5-氮胞苷对葡萄生长的影响较大，总体上100、200 µmol·L-1可不同程度的缓解铝毒伤害，但100 µmol·L-1的效果最好，400、800 µmol·L-1反而加重铝毒伤害，阻碍植株生长发育，可能是植株受到铝胁迫和5-氮胞苷的双重伤害。

表1 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄形态指标的影响Table 1 Effects of 5-azacуtidine on morphological indexes of grape under aluminum stress

2.2 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄生理指标的影响

从表2可看出，铝胁迫下的葡萄叶片MDA含量比对照明显提高。5-氮胞苷处理后，MDA含量大幅度下降，T1、T2、T3的MDA含量显著低于T0，分别下降了54.13%、31.67%、15.34%。从表2还可看出，T0叶绿素和类胡萝卜素与CK相比显著下降，但一定浓度的5-氮胞苷可减缓这种现象，其中T1与T0叶绿素a＋b、类胡萝卜素之间的差异显著，分别上升11.35%、34.31%。由此可见，铝胁迫下，100 µmol·L-1的5-氮胞苷可降低MDA含量，提高叶绿素含量，对增强植株的耐铝性具有重要作用，从而减缓铝胁迫对植株的毒害。

表2 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄叶片生理指标的影响Table 2 Effects of 5-azacуtidine on phуsiological indexes of grape leaves under aluminum stress

2.3 5-氮胞苷对葡萄脯氨酸、可溶性蛋白质的影响

从图2可看出，铝胁迫下脯氨酸含量迅速合成并积累。在整个试验期，铝胁迫下的脯氨酸含量均显著高于CK，而T1、T2显著低于T0。从图2还可以看出，在整个试验期，所有处理的蛋白质含量均显著低于CK；14、21 d时，T0的蛋白质含量显著低于其他处理；35 d时，T1、T2的蛋白质含量显著高于T0，而T3、T4显著低于T0。可见，铝胁迫下，喷洒100、200 µmol·L-1的5-氮胞苷后，可减少脯氨酸的积累和加快蛋白质的合成，从而减缓铝胁迫对植株的毒害，增强植株的耐铝性。

图2 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄叶片脯氨酸和蛋白质的影响Figure 2 Effects of 5-azacуtidine on proline and protein in grape leaves under aluminum stress

2.4 5-氮胞苷对葡萄叶片SOD和POD活性的影响

SOD和POD二者联合作用保护植物，能够避免自由基积累对生物膜造成破坏。从图3可看出，从试验开始的7～35 d，4个处理的SOD和POD活性都低于CK；21、28、35 d时T1、T2、T3、T4的SOD活性显著高于T0，其中T1又显著高于T3、T4。从图3还可看出；14 d时，T2的POD活性显著低于其它处理；21、28、35 d时，T1显著高于T0，T3、T4显著低于T0。可见在铝胁迫下，植株SOD、POD活性减弱，喷洒100 µmol·L-1的5-氮胞苷可缓解这种现象，此浓度的5-氮胞苷对提高葡萄耐铝性发挥了一定的作用。

图3 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄叶片SOD和POD活性的影响Figure 3 Effects of 5-azacуtidine on SOD and POD activities in grape leaves under aluminum stress

2.5 5-氮胞苷对葡萄叶片氮、磷、钾的影响

从图4可看出，7、14 d时，T0的氮含量最高，其次是T1，而T4则最低；21、28、35 d时，T1、T2均显著高于T0，其中T1在21、28 d时高于CK；7 d时，T0的磷含量显著低于CK、T1、T4；14～35 d时，T0均显著低于CK、T1、T2；T1除14 d外其它时期均显著高于T2、T3、T4；7 d时，T0的钾含量显著低于CK、T3、T4；14、21 d时，T0显著低于其它处理；28、35 d时，T0显著低于CK、T1、T2，T4显著低于T0。可见，铝胁迫下葡萄叶片的氮、磷、钾积累量均不同幅度的被抑制，但使用100 µmol·L-1的5-氮胞苷可明显减缓这些营养物质被抑制的程度，从而提高植株耐铝性。

图4 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄叶片氮、磷、钾的影响Figure 4 Effects of 5-azacуtidine on nitrogen, phosphorus and potassium in grape leaves under aluminum stress

2.6 5-氮胞苷对葡萄可溶性糖、淀粉的影响

从图5可看出，7～35 d，CK的可溶性糖和淀粉含量均高于其它处理。7 d时，T0的可溶性糖含量显著低于其它处理；21 d时，T1、T2显著高于T0；28 d时，T1显著高于T0；35 d时，T1、T2显著高于T0，T3、T4显著低于T0。从图5还可看出，7 d和14 d时，T0的淀粉含量显著低于其它处理；21 d时，T1、T2显著高于T0；28 d和35 d时，T1显著高于T0，T2、T3、T4显著低于T0。可见，铝胁迫下使用100 µmol·L-1的5-氮胞苷可明显提高可溶性糖和淀粉含量在葡萄叶片中的积累。

图5 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄叶片可溶性糖和淀粉的影响Figure 5 Effects of 5-azacуtidine on soluble sugar and starch content in grape leaves under aluminum stress

2.7 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄叶片铝含量的影响

从图6可看出，整个试验期间，CK的铝含量均低于其它处理。7 d时，T0的铝含量显著高于其它处理；14 d时，T1显著低于T0；21、28、35 d时，T1、T2、T3显著低于T0，此外T1显著低于T2、T3、T4。由此可见，本研究中铝胁迫下的铝含量大量积累，但喷洒5-氮胞苷可降低铝含量的积累，其中100 µmol·L-1的5-氮胞苷效果最显著，显著增强了植株的耐铝性，对提高铝胁迫下植株的适应性发挥了重要作用。

图6 5-氮胞苷对铝胁迫下葡萄叶片铝含量的影响Figure 6 Effect of 5-azacуtidine on aluminum content in grape leaves under aluminum stress

3 讨论与结论

逆境胁迫会引起植物体内DNA甲基化水平的改变，导致植物生长发育的不正常和形态异常[22]，植物在遭受铝毒害时根系出现的症状最明显，表现“短而粗硬且不分枝”，植株形态严重萎缩，大大减弱植株抗逆性[3]。5-氮胞苷可降低植株体内的DNA甲基化水平，提高植株的抗逆性，缓解逆境胁迫下的伤害[23]。植物生长受抑制的直观体现是生物产量，本研究表明，铝胁迫使葡萄株高、根鲜质量、根长和根体积减少，茎粗增大，根冠比降低，与黄守程[24]、张永福[25]研究结果一致，此时地上部和地下部生物量都减小，铝全面入侵植株。本研究中100、200 µmol·L-1的5-氮胞苷喷洒后可增加葡萄株高、降低茎粗，促进根系统发育。

本研究中，铝胁迫下，叶绿体被膜受到破坏，抑制光合作用，膜脂过氧化加重，从而导致叶绿素下降和丙二醛大量积累；100 µmol·L-1的5-氮胞苷喷洒后，可增强叶绿素和减弱丙二醛的积累。脯氨酸可以减少细胞质膜受到外界影响，蛋白质是生理功能的执行者[26]，本研究中，铝胁迫下渗透调节失衡导致生理功能执行力下降，脯氨酸含量上升，蛋白质含量下降；喷洒100、200 µmol·L-1的5-氮胞苷后，可缓解这种现象，与黄菲[27]的研究结果相似，即5-氮胞苷提高盐胁迫下水稻蛋白质含量。SOD和POD作为植物体内清除活性氧的关键酶，SOD将O2-歧化成H2O2和O2，POD将H2O2分解为H2O和O2[28]。本研究中，在铝胁迫下植株细胞膜伤害加重，细胞代谢产物活性氧大量积累，SOD和POD的活性均受到强烈抑制，喷洒100 µmol·L-1的5-氮胞苷可增强其活性，与李鹏程[29]研究结果相似，即干旱胁迫下5-氮胞苷可提高马铃薯SOD和POD活性。本研究还发现，铝胁迫下根系中的铝向上运输的能力增强，削弱了矿质元素氮、磷、钾从根系向上运输的能力，从而减弱氮、磷、钾的吸收能力，降低其转运能力和在叶内的积累；喷洒100 µmol·L-1的5-氮胞苷后，缓解铝在叶片中的积累从而增强营养物质的运转，与潘雅姣等[30]研究结果相似，即5-氮胞苷提升了水稻中氮、磷、钾含量，提高了水稻耐旱性。

植物在逆境胁迫下的生长状况可以评价该种植物的抗逆性。5-氮胞苷在达到一定浓度时，也具有一定的正向效应。低浓度的5-氮胞苷可以起到促进作用，而高浓度反而起抑制作用[27]，本研究中较高浓度（400、800 µmol·L-1）5-氮胞苷对葡萄生长产生了双重毒害作用，减弱葡萄耐铝性，不但抑制葡萄植株根系发展，无法进行正常的光合作用，而且营养物质得不到吸收，最终导致植株形态萎缩严重，甚至干枯死亡。这可能是由于5-氮胞苷浓度太高，使DNA甲基化水平大幅度降低，基因表达增强，从而消耗了体内的营养物质，产生该现象的原因还有待进一步研究。

本研究中，100 µmol·L-1的5-氮胞苷缓解铝胁迫的毒害效果显著，5-氮胞苷可能通过络合铝减轻铝毒害，抑制铝向地上部运转和提高光合色素协同作用，抑制活性氧和激活氧化防御系统，降低渗透调节物质积累，促进矿质元素的吸收、有利于蛋白质、可溶性糖、淀粉的合成，从而使细胞膜免遭破坏，增强葡萄对铝胁迫的适应能力。由此可见，100 µmol·L-1的5-氮胞苷在提高葡萄苗的耐铝性中发挥了重要作用。