害虫种群分子调控技术及在森林害虫防控研究中的进展

张苏芳张荣张真

(中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所，国家林业和草原局森林保护学重点实验室，北京 100091)

害虫是森林生态系统的重要干扰因子，对森林健康、林业生产和生态环境都造成了严重的破坏。随着害虫管理方法的不断丰富，害虫管理的理念也从消灭害虫转变为综合管理。近年来，生态管理的新思路出现[1]，遵从害虫自身的生态发展规律，注重预防[2]，而不是害虫发生后再补救。

害虫管理策略的不断进步离不开害虫防治方法的不断进展。物理防治在成本、效率方面存在不足，化学防治虽然成效显著，但是随之带来的3R问题则给人们更加严峻的考验。信息素监测及防治技术[3]、生物防治技术[4]具有环保、针对性强等优点，更加符合现代害虫管理的要求。这些害虫防治方法在人类管理害虫的过程中发挥了重要作用，但是新的问题也不断出现，亟待开发新型绿色、高效、精准的害虫防治技术。

随着昆虫分子生物学研究的不断深入，人们对害虫成灾相关基因及其功能逐步了解，并开始利用分子生物学进行害虫管理。通过一定的分子操作对害虫成灾关键基因的表达进行调控，有望开发害虫管理新技术。能够实现调控害虫成灾关键基因表达的RNA干扰[5]和遗传防控[6-7]技术成为目前极具应用前景的害虫分子调控技术。

1 基于RNA干扰的害虫分子调控研究进展

1.1 RNA干扰的概念和基本原理

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)特异性、高效地诱导生物体内靶标基因 mRNA沉默的现象[8]。RNAi按照生物体的复杂程度，分为细胞自主型(cell-autonomous)或非细胞自主型(noncell-autonomous)两类。单个细胞内发生的RNAi为细胞自主型，其基本原理是，外源性的dsRNA进入细胞后，被降解成19～21 bp长度的干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)，然后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，通过碱基配对特异性的结合在同源 mRNA(靶标)上切断靶标 mRNA，引发靶标 mRNA的分解，从而产生靶标基因的表达沉默[9]。非细胞自主型RNAi包括系统性 RNAi(systemic RNAi)和环境RNAi(environmental RNAi)，是指 RNAi可从起始位点传递至其他细胞或组织[10]，其过程包括dsRNA的获得和输出、干扰信号进入其他组织、最终目的基因通过细胞自主型RNAi被沉默。

1.2 RNAi在害虫防治中的潜力

RNAi能够特异性地降低或关闭靶基因表达，因此成为基因功能研究的重要手段。另一方面，通过对昆虫基因功能的研究，可筛选出控制生长发育的关键靶基因，这样就可以结合RNAi技术，对相关基因进行沉默，达到有效防控害虫的目的。

相较于传统的害虫防治方法，RNAi技术具有独特的优势。首先，该技术只针对特定昆虫的特定基因进行基因沉默，因此具有昆虫选择性和基因特异性，可以特异高效地干扰害虫靶标基因表达，进而控制害虫的发生危害。其次，dsRNA导入生物体后一般在半天内就可以起效[11]，周期短，节省时间成本。最后，对非靶标昆虫影响较小，RNA易降解，无残留，是生物多样性和环境友好型的害虫防控方法。dsRNA可被制备成用于喷雾或灌溉施用的制剂，大面积地施用于田间等[12]。因此，RNAi技术是至今为止最有可能应用于害虫防治的生物工程技术[5]。例如孟山都公司研发的表达靶向玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera的RNAi转基因玉米已经获得美国农业部(USDA)和环保署(EPA)批准，即将开展商业化应用[13]。

1.3 影响RNAi在害虫防治应用方面的因素

将RNAi应用于害虫防治，需要的基本条件包括有效的靶标分子和高效的递送系统。然而，并不是所有的昆虫都具有高效的RNA干扰途径，而dsRNA递送方式的便捷性、成本等也是影响RNAi作为一种害虫防治手段的关键因素。

1.3.1 干扰效率及差异因素

RNAi的干扰效率在不同昆虫类群中差异显著。总体来说，RNAi在鞘翅目昆虫中是高效且系统性的。在许多经济上重要的鞘翅目昆虫[14-16]中，注射或口服dsRNA可诱导强烈的系统性RNAi反应。而RNAi效率在鳞翅目、双翅目、膜翅目和半翅目昆虫中却具有不确定性，这些目包含了很多重要害虫、病媒和有益昆虫[17-19]。

对于不同昆虫RNAi干扰效率的研究证明，以鳞翅目等为代表的RNAi不敏感类群聚集了诸多不利于RNAi行使功能的因子。首先，鳞翅目和半翅目昆虫的核酸酶活性高于其他昆虫[20-21]。dsRNA被取食后第一道关卡是消化道内的dsRNA酶。对昆虫核酸酶降解dsRNA的比较研究表明[20]，RNA干扰效率不同的昆虫，其核酸酶活性存在显著差异。第二，dsRNA不能被细胞吸收转运。在鞘翅目昆虫中，dsRNA可以通过内吞作用等被转移到细胞质中，并在细胞质中转化为siRNA；而在鳞翅目昆虫中，如草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda，RNAi不能有效工作，细胞内运输效率低下，大多数dsRNA不能从内涵体逃逸，因此不能转化为siRNA[18]；不同的昆虫组织对dsRNA的吸收也存在差异，例如，注射到飞蝗Locusta migratoria的dsRNA不会被卵泡细胞和卵母细胞吸收，因此在这些组织中不会触发RNA干扰[22]。第三，dsRNA进入细胞质后通过Dicers加工成siRNA，而dsRNA转化为siRNA的过程因昆虫而异。异翅亚目、鳞翅目、直翅目和双翅目昆虫的dsRNA加工成siRNA的效率不如鞘翅目昆虫[20]；最近的研究表明，仅在鞘翅目昆虫中检测到一种RNA结合蛋白Staufen C，它参与将dsRNA加工成siRNA，而在其他昆虫中未检测到该蛋白[23]。第四，重要RNAi功能基因Ago的分化。基因进化的研究表明，Ago基因经历了频繁的进化扩展，导致其功能分化[24-25]。最后，不同昆虫体内的生理条件也会影响RNAi效率。例如鳞翅目昆虫中观察到的消化腔内高碱性pH值，可能对成功的RNAi有害[26]。

在RNAi干扰研究中，可采取一定措施提升干扰效率。例如，对于鳞翅目昆虫，适当加大dsRNA注射量，可提高干扰效率。例如，增大美国白蛾Hyphantria cunea幼虫dsRNA的注射量，可增加干扰效果持续时间[11]，这可能是足量的dsRNA抵消了一部分降解带来的不利影响。同时，也应注意干扰时期的选择，把握目的基因的表达规律，在表达高峰期进行干扰，才能获得最佳干扰效果[11]。对于飞蝗，选择注射dsRNA才能高效干扰靶标基因，而饲喂dsRNA则效果欠佳[27]。

RNAi靶标基因的选择在害虫防治中受到多方面影响，并非所有基因都适合作为控制害虫的靶标基因。首先，杀虫靶标基因应该是对昆虫生长、发育、行为具有重要影响的基因；其次，鉴于卵和蛹期昆虫处于相对静止状态，与外界互动较少，难于实施RNAi，因此幼虫和成虫发育时期的关键基因更有可能作为候选的致死基因；最后，基于安全性考虑，靶标基因的筛选不仅要考虑能够杀死害虫，同时还要确保对非靶标生物如人类和哺乳动物等的安全性，避免脱靶效应(off-target effects)对非目标生物的潜在危害等。这些因素都可能影响RNAi的效率，因此在害虫靶标基因筛选过程中，需要综合考虑。

1.3.2 dsRNA递送方法的研究进展

RNAi干扰效率研究能解决高效靶标分子的获得问题，如何将靶标基因的dsRNA便捷高效地递送到害虫体内，并发挥干扰作用，则是影响RNAi能否最终成功应用的关键因素。靶标基因的dsRNA递送到昆虫体内发挥作用，基本的方式可以通过注射、经皮(浸泡)、经口(饲喂)三种途径。这方面的研究近几年获得长足进步[28]。

注射法可以绕开表皮和肠道上皮的屏障作用、核酸酶及不利生理环境等，将dsRNA有效而精准的传递到昆虫体内，还可以在特定发育阶段立即直接将定量dsRNA输送到昆虫体内，甚至输送到特定的身体部位，因此对于靶标基因的功能分析具有独到的优势。然而，注射法对仪器有较高要求，微小昆虫操作起来存在不便，最重要的是不适用于田间应用。

经皮和经口导入dsRNA，在昆虫中具有操作便利、有应用潜力的优点。近年来，针对昆虫dsRNA导入效率提升的最新进展，大部分结合了经皮和经口导入方式。

1.3.2.1 植物介导的昆虫dsRNA递送方式 植物介导的dsRNA递送，实际上是经口导入的优化。直接在植物中表达目标害虫的靶标dsRNA，可以精准控制目标害虫，无需多余的人力物力投入，具有巨大的应用潜力。实际上，第一个被批准且商业化种植的防治玉米根萤叶甲的转基因玉米就是基于植物介导dsRNA递送[13]。2007年两篇论文几乎同时在《Nature Biotechnology》发表，表达dsRNA的转基因植物分别是靶向棉铃虫Helicoverpa armigera的棉花[29]和靶向玉米根萤叶甲的玉米[30]。该递送方式的这两项突破性进展，引发了一系列利用转基因植物表达dsRNA来控制害虫的研究。

然而，该方式对于许多昆虫的控制效率并不高。究其原因，是植物中表达的dsRNA大部分被加工成siRNA，大大减少昆虫取食植物时摄入的dsRNA，从而影响了在昆虫体内的干扰效果[31]。针对该问题，张江教授团队利用植物叶绿体中缺乏Dicer酶的特征，将dsRNA表达定位于植物叶绿体DNA，效果远优于普通的细胞核转化方式[32]。该方法适用于取食细胞和组织的害虫(如咀嚼式)，具有未来进一步扩大利用RNAi进行害虫防治的前景。

1.3.2.2 基于稳定性和穿透效率提升的dsRNA递送方式 并不是所有植物都便于转基因并频繁种植，例如森林生态系统中的大部分多年生植物更替较慢，替换表达dsRNA的植株周期长，不具有可操作性。此外，转基因植物的公众接受度和潜在风险也限制了植物表达dsRNA方式的运用。因此，改进dsRNA自身的递送方式，开发具有时间短、开发成本低、抗性风险低、调控过程简单、对所有作物都具有可行性优势的方式，其意义重大。

dsRNA对害虫表皮的穿透能力和稳定性有限是RNAi效率的重要影响因素，因此在实际害虫防治过程中，需要设法进一步提高其穿透效率和稳定性，进而提高对靶标的干扰效率。纳米材料因尺度微小，具有表面积大、表面能高等诸多优势，其与dsRNA结合组成的纳米递送系统，具有高效、稳定、缓释、无污染等优点，近年来发展迅速。壳聚糖是一种天然纳米材料，安全性好、可降解，是首批用于dsRNA递送系统的纳米材料[33]。中国农业大学沈杰教授团队构建的星形阳离子聚合物(star polycation，SPc)，在提高外源dsRNA穿透害虫体壁能力、提升杀虫效率方面效果显著，在害虫防治领域展现出广阔的应用前景[34]。

脂质体递送是另外一种提高dsRNA递送效率的方式。阳离子脂质和带负电的dsRNA互作后形成脂质复合体，可有效增加dsRNA的吸收效率，延缓其在肠道内的降解，从而提高干扰效率[35]。

1.3.2.3 微生物介导的dsRNA递送方式 微生物能够快速、低成本合成dsRNA。如果表达dsRNA的微生物能够与昆虫共存，则可源源不断地提供dsRNA，具有可持续性、时间短、抗性低等优势，结合植物表达dsRNA和外源提供dsRNA的双重优势，撇弃了植物表达dsRNA周期长和外源提供dsRNA不可持续的缺点，具有很大的应用潜力。

要想达到表达dsRNA的微生物与昆虫共存的效果，肠道共生菌是理想的表达容器。鉴定和分离合适的昆虫肠道共生菌，并对目标共生菌进行改造，获得 RNase III缺陷(不降解 dsRNA)、生产双链RNA的菌株[36]，借助共生菌通过种群水平传播或者垂直传播途径可以实现害虫种群的防治。值得指出的是，后肠的核酸酶含量较低[37]，后肠共生菌用于dsRNA递送也具有相应的优势，在未来可加强鉴定和研究。

微生物介导的dsRNA递送系统，不仅可以瞄准昆虫本身携带的微生物，也可以借助植物的内生菌、病毒表达dsRNA，并间接递送给害虫。该方法对于多年生植物、或者转基因难度大的植物较为适用。

1.3.2.4 dsRNA 递送方式的选择 dsRNA 的递送方式多种多样，实际研究和应用中可以根据昆虫特性、研究目的选择合适的dsRNA递送方式。

注射法具有定量、快速等优点，是进行基因功能研究的首选，然而，该方法不适于害虫防治。对于某些昆虫，如直翅目中的飞蝗，只选取注射法来进行RNAi[27]。对于个体微小、操作不便的昆虫，或者一些幼龄期昆虫，可以采取经皮(浸泡)的方式，对靶标基因进行高通量筛选[38]。植物表达dsRNA需要构建转基因植株，因此针对某些饲喂干扰效果较好的专食性昆虫、重要性经济作物的重大害虫比较实用[29-30]。对于广食性害虫、寄主更替较慢的害虫(如森林害虫)，工程菌介导的dsRNA由于在成本、大量繁殖方面具有优势而更加实用。

当然，dsRNA的递送方式不是唯一的，可以利用注射来筛选合适的靶标基因，再选择合适的递送方式开发害虫控制技术；而纳米技术等增强dsRNA效率的技术也可用于注射、浸泡、饲喂等多方面，提高各种基因的干扰效率。

1.4 森林害虫RNAi研究进展

RNAi作为害虫防治的新技术在森林害虫中展开尝试是近几年才开始的，且集中在几种危害严重的森林害虫中[39-40]。目前，鞘翅目森林害虫相关研究进展迅速。最早在2015年，白蜡窄吉丁Agrilus planipennis的 RNAi通路重要基因鉴定工作完成[41]，大多数参与RNA干扰途径的基因被鉴定。随后在该虫中开展了一系列基因的RNAi效果测定和靶标筛选[16]，并使用L4440菌株表达dsRNA的方式尝试饲喂法进行害虫基因干扰，为防治打下了基础[42]。在光肩星天牛Anoplophora glabripennis中也进行了相似的研究[43]，获得了可用于防治的靶标基因[44-45]。最近，在几种大小蠹中开展了RNA干扰有效性测试，并进行基因功能研究或者防治靶标筛选。这些大小蠹包括华山松大小蠹Dendroctonus armandi[46-47]，美国南方松大小蠹Dendroctonus frontalis[48]以及中欧山松大小蠹Dendroctonus ponderosae等[49]。RNAi作为鞘翅目森林害虫一种防治策略已经受到越来越多的研究人员重视，相信未来相关研究会蓬勃发展。

除了鞘翅目害虫，仅在鳞翅目几种害虫中展开了RNAi研究，包括美国白蛾[50]、舞毒蛾Lymantria dispar[51]、柚木驼蛾Hyblaea puera[52]和云杉色卷蛾Choristoneura fumiferana等[53]。其中，美国白蛾的RNAi防治研究工作开展较为深入。美国白蛾的RNAi始于几丁质脱乙酰酶和中肠氨肽酶N功能研究[54-55]。最近，中国林业科学研究院的张真课题组对美国白蛾开展了RNAi靶标筛选[11]，并构建了带有美国白蛾几丁质酶dsRNA表达载体的菌株[56]，为该物种的基因功能研究和防治提供新技术支持。

总体上，RNAi已经是森林害虫基因功能研究的重要手段[50-51，57]，为基于RNAi的森林害虫防治提供了良好靶标。所使用的dsRNA导入方式以注射和饲喂为主，个别物种开展了L4440菌株表达dsRNA饲喂、转基因植物[58]介导的尝试。未来，在增加高效靶标基因筛选的基础上，应推进更多的林业害虫dsRNA导入技术研究和应用，如转基因植物(对于那些更新较快的树种)、纳米载体导入、微生物介导的dsRNA导入等。

2 基于遗传防控的害虫分子调控研究进展

害虫遗传防治(genetic pest management，GPM)是一种利用遗传学原理防治害虫的新方法，旨在利用害虫的自然交配系统，以便将不育、致死或以其他方式改变种群的性状引入害虫种群[59-60]。20世纪30年代前，国外有关GPM的研究就已经开始，到现在已经积累了很多宝贵的经验，新的技术手段也层出不穷[61-63]。21世纪之前，GPM的主要技术手段有昆虫不育技术(sterile insect technique，SIT)、染色体易位(chromosome translocation)[64-65]。传统不育技术是采用化学药剂处理、射线辐射等方式使昆虫不育。21世纪之后，分子生物学、遗传学等的快速发展促进了一系列新型GPM技术手段的产生，包括显性致死昆虫释放技术(release of insects carrying a dominant lethal，RIDL)、归巢核酸内切酶基因(homing endonuclease gene，HEG)、锌指核酸酶(zinc-finger nuclease)、CRISPR/Cas系统等[66-67]。本综述重点总结基于分子生物学技术的新型遗传防治研究相关进展。

2.1 遗传防治的策略

2.1.1 显性致死昆虫释放技术

1982年，Rubin和Spradling利用P转座子，将外源基因插入到黑腹果蝇Drosophila melanogaster的基因组中，获得了世界上第一个人为控制的转基因昆虫，启发了专家学者通过转座子技术开发新型害虫遗传防治策略[68]。RIDL首先被Thomas和他的团队们命名。他们利用黑腹果蝇作为研究对象，开发出了雌性特异性条件致死系统。第一个系统使用性别特异性启动子或增强子来驱动可抑制转录因子的表达，进而控制有毒基因产物的表达，第二个系统使用可抑制转录因子的非性别特异性表达来调节选择性致死基因产物[69]；同年，Heinrich和Scott也利用黑腹果蝇作为研究对象，基于相同的原理，体外构建了一个复合转座子(transposons with armed cassettes，TAC)，导入黑腹果蝇体内形成转基因昆虫[70]。利用特殊遗传标记筛选转化品系是构建RIDL过程中的重要步骤，目前常用手段是添加荧光基因并使用启动子驱动，这样既能够大幅度降低筛选的难度，也利于后期监测[72]。目前开发的RIDL品系主要来自英国 Oxitec公司，大多数以蚊子为主，包括埃及伊蚊Aedes aegypti、冈比亚按蚊Anopheles gambiae等。

2.1.2 基因驱动

基因驱动的理念源于归巢核酸内切酶介导的超孟德尔遗传现象(super-Mendelian inheritance)[72]，即某些特定基因型或特定性状在种群中被有偏好性地遗传给后代的现象。随着CRISPR/Cas9技术的发展，人们提出了基于该技术便捷的基因编辑能力发展的基因驱动模型[73]。前面提到的辐射不育技术和RIDL技术，都是自我限定(self-limiting)的遗传控制策略，它们在遵守孟德尔遗传定律的前提下，能够将突变基因遗传给下一代，但是在种群中的比例是逐渐减少并可能消失的，因此需要源源不断地释放改造后的昆虫来维持控制效果；而基因驱动技术则能够将突变基因快速扩散，从而能够自我维持(self-sustaining)，甚至完全替代野生种群。简单来说，某些特定基因型或特定性状在种群中有被偏好性地遗传给后代的现象，也称为超孟德尔遗传(super-Mendelian inheritance)，人们利用该现象中的元件，构建出能够使目的基因在种群内以超孟德尔频率传播的基因驱动系统。该策略已经在黑腹果蝇[74]、斯氏按蚊Anopheles stephensi[75]以及冈比亚按蚊[73]等模式昆虫中加以实践。该策略的强大控制效果拓展了害虫遗传防控的应用潜力，甚至由于其极强的种群侵入性和不可逆性，引起了人们对安全和道德问题的担忧。未来，需要在如何科学利用现代工具、合理控制害虫方面进一步开展工作。

2.1.3 遗传防控中的最新基因操作工具CRISPR/Cas系统

CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat)是成簇规律间隔短回文重复序列，广泛存在于许多原核生物中，包括大多数细菌和古细菌。这些短重复序列与侵入细菌的外来DNA序列(如病毒DNA)互补。当病毒感染细菌时，细菌会产生病毒DNA的互补序列与病毒DNA结合，然后使用一种叫做Cas的核酸酶将入侵的DNA切割成碎片。因此，CRISPR/Cas是原核生物对抗病毒的一种获得性免疫防御机制，它也是一种自然产生的基因组编辑工具[76]。CRISPR最早是在1987年从大肠杆菌中克隆出的[77]，2005年科学家发现了其在细菌防御机制中的功能[78]。2012年，两个独立的实验室报告称，CRISPR/Cas系统可以在体外重建。体外重建的CRISPR/Cas系统具有生物学功能，能切割单个DNA片段，为使用CRISPR/Cas作为基因组编辑工具提供了基础[79-80]。

根据Cas蛋白的不同，CRISPR/Cas系统可分为I，II，III型。 其中II型 CRISPR/Cas系统组成简单，研究相对比较深入，也是目前被改造最成功的人工核酸酶系统，即CRISPR/Cas9系统。其工作原理简介如下:Cas9是一个1 049个氨基酸的核酸酶，含有RuvC-like和HNH两个结构域，在细菌中，Cas9能够对双链 DNA进行切割，但是需要 CRISPR RNA(crRNA)和tracerRNA介导。后续研究表明，crRNA和tracerRNA可以一起构建，形成一个单一的嵌合合成RNA分子，称为单导向RNA(sgRNA)。实际利用CRISPR/Cas9进行基因编辑时，只要根据需要设计与目标序列互补的crRNA，然后将其和tracerRNA拼装起来得到sgRNA。Cas9上的HNH结构域切断与sgRNA配对的目标链，而另一个结构域RuvC-like切割目标链的互补链。双键断裂后，有机体会对DNA进行修复，从而产生突变、缺失等[80]。目前利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑逐渐成为潮流，在害虫遗传防治方面也有所进展。

2.2 遗传防治的成功案例

基于SIT的库拉索岛新大陆螺旋蝇Cochliomyia hominivorax[81-83]拔除计划和坦桑尼亚桑给巴尔的温古贾岛采采蝇Glossina austeni[84]消灭项目，是早期害虫遗传防控的典型案例。而基于分子生物学的现代遗传防治在蚊子中得到系列应用。

以伊蚊和按蚊为代表的蚊类给人类生活带来了极大困扰，蚊媒病毒的传播更威胁到了很多人的生命，因此人类与蚊子的斗争由来已久[85]。Oxitec公司开发的蚊子RIDL品系在多个地区应用并取得了显著的效果。埃及伊蚊OX513A品系最早开发于2007年，室内和野外试验都表明该品系与野生型在个体大小、生殖力、抗性、营养利用、飞行能力等方面接近。2010年Oxitec与马来西亚政府合作对该品系进行的非栖息地野外释放试验结果显示，释放的转基因雄蚊与当地野生型雄虫在平均寿命和交配竞争力等方面没有显著差异[86]。随后进行的栖息地释放测试表明，OX513A雄虫不仅与当地野生型雄虫竞争力相当[87]，而且能够有效降低野生埃及伊蚊的种群密度[88]，从而阻止登革热等疾病的传播。2014年以来，印度、巴拿马等国家也利用RIDL蚊子对病原蚊源进行防控[89]。随着基因驱动技术的发展，蚊子成为基因驱动技术应用的先驱物种之一，斯氏按蚊[75]和冈比亚按蚊[73]中都成功开发了基因驱动系统。最近，英国伦敦帝国理工学院利用基因驱动技术开发了只产生雄虫的冈比亚按蚊品系[90]，从而控制蚊子叮咬人类和传播疾病。未来在进一步保障安全的基础上，遗传防控技术可以为科学防蚊、阻断蚊媒疾病提供科技支撑。

2.3 森林害虫遗传防治研究进展

森林害虫遗传不育技术也有一定的研究进展。辐射不育技术吸引人们对天牛类害虫遗传防控的尝试，其中松墨天牛Monochamus alternatus[91-93]、桑天牛Apriona germari[94-95]、光肩星天牛[96]都进行了辐射剂量筛选和不育效果测试等方面的尝试，未见大规模应用。

基于基因编辑的森林害虫遗传调控技术在美国白蛾中有较为深入进展。刘慧慧等[97]通过对重要发育基因Wnt-1的研究明确，CRISPR/Cas9基因组编辑技术可以对美国白蛾基因组进行高效编辑，HcWnt-1突变造成美国白蛾胚胎期死亡，可作为未来美国白蛾遗传防治的靶标基因。美国白蛾性别特异性致死遗传防控体系的构建，离不开对其性别确定机制的研究。doublesex基因(dsx)在性别决定中起着关键作用，由于其性别特异性剪接，它还显示了害虫管理中的应用潜力。最近，Li等[98]利用CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除获得3种Hcdsx突变体，发现很多性二态性征的突变表型，导致突变体无法完成正常的交配、产卵和受精等生殖行为，造成性别特异性不育表型。这为美国白蛾遗传防控品系的构建奠定了基础。此外，在重要针叶林食叶害虫松毛虫中也实现了基于CRISPR/Cas9系统的特定位点突变[99]，为害虫遗传防控提供了技术支持。

3 问题与展望

森林害虫是我国森林生态系统的主要威胁之一，对于我国生物安全和生态文明建设造成重要影响。害虫分子调控技术的开发是解决森林害虫现有威胁的新策略之一。当前害虫遗传调控技术研究以卫生害虫为主[6]，以RNAi为手段的害虫调控技术在农业害虫中也有一系列进展[100]，但是对于每年都能造成巨大损失的森林害虫来说，有关遗传调控和RNAi的研究还较少，且集中于个别类群中。

未来，森林害虫分子调控技术的开发还需要在靶标鉴定和实施技术开发两方面改进。首先，加强森林害虫成灾机制的研究，从而挖掘适用于分子防控的高效靶标。其次，借助最新技术提高dsRNA导入技术效率，从而为基于RNAi的分子调控技术开发铺平道路。再次，森林害虫分子遗传防治技术的开发需进一步完善，为构建用于防治的森林害虫新品系提供基础，从而在复杂的森林生态系统中充分利用分子调控技术的便捷、可持续等特性。分子调控技术在森林害虫防治中的应用，还要注重生物安全的问题，从而使得这些新型技术得到合理应用。

任何一种技术都存在优势和不足，如何协调新型分子调控技术和传统害虫防治技术，从而使不同的害虫防治技术发挥最佳效果，是未来害虫综合防控和生态管理需要研究的重要方面。