超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法测定水中喹诺酮类抗生素的研究

李志广

摘要：喹诺酮类抗生素是一种经过人工合成的抗菌药物，除了作为医疗药物使用以外，它还主要被当作畜牧业饲料的添加成分，目的是提高饲料的有效利用率以及畜牧养殖动物的抗病害能力。以往传统的免疫法测定喹诺酮类抗生素的水质检测技术不仅测定周期长，且极容易因不确定的外部环境因素影响测定结果的准确性。基于此，对一种基于固相萃取检测的液相色谱三重四级杆质谱联用测定法，在水中喹诺酮类抗生素测定试验上的应用进行理论讲解。希望通过此文可以为水质检测部门，在畜牧业污水质量测定上提供一定的理论帮助。

关键词：喹诺酮类抗生素;固相萃取;三重四级杆质谱联用

1.              试验前期准备

1.1试验仪器

考虑到畜牧业污水的化合基质成分比较复杂，为了可以获得远高于单四级杆质谱联用仪的信噪比，仪器选用型号为Agilent 7000B GC/MS Triple Quad的液相色谱三重四级杆质谱联用仪，这种仪器可以在背景样品中对水中喹诺酮类抗生素的目标化合物进行选择性定量，质量稳定性水平在±0.1m/z以内，信噪比大于180：1，检测限的精度等级上基本达到了飞克标准，配套色谱柱规格为21mm*50mm，φ1.7μm。

除了仪器之外，试验中还准备了SPE固相萃取仪，电源电压220V，频率50Hz，仪器配备通道数量5条，单条通道流速≤16.10ml/min，样品泵管转速100rpm，萃取准确度为2.5%，仪器运行档位有三个，分别为流量档位、液量分配档位和时间节点档位，仪器输入阀值为100psi，输出阀值为30psi。

NAI-DCY-12ZG自动型干式氮吹仪，配备12孔圆形水浴，借助仪器配套自带的Product description软件，可以将氮吹仪运行示数在前端操作面板上以可视化的数字显示形式呈现。

1.2材料准备

水中喹诺酮类抗生素测定试验中主要使用如下几类化学药剂：工业优级纯度氢氧化钠固体;工业优级纯度稀硫酸溶液;色谱纯度乙腈;NOR、OFL、ENR标准物质;蒸馏提纯过的去离子水。

2.              仪器分析条件

在进行实际测定之前，首先应当利用甲醇溶液对测试样本进行定性处理，将甲酸溶液与甲醇溶液分别梯度洗脱至80%与15%，洗脱时间设置为5min后，采用正乙烷作为无水有机溶液将两份样本进行定容。而后在将两组不同洗脱度的溶液装进3个样本泵管中进行实际测试，收集仪器的采集信号，直至三组泵管样本定量的平行性符合仪器测定标准。

3.              固相萃取样品制配

将待测定的水质样本装入固相萃取样本柱管内，首先加入6ml乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶液，它是固相萃取中用于配位滴定的配合物。而后再向样本柱管内通入6ml二氯甲烷进行活化，静置5min后加入6ml甲醇溶液标定。而后调整固相萃取样本的pH值，使送样可以通过固相萃取仪的富集柱管。在固相萃取仪中完成富集过程后，将柱管安置于氮吹仪的水浴孔上进行至少20min的氮吹，而后用10ml的洗脫液将水质样本的待检测物转移至洗脱液内，收集洗脱液并氮吹至全干，最后用初始流动相将固相萃取样本进行定容制样。在固相萃取样本的制配工序中，最后过孔径为0.2μm的膜时送样中不能含有无机酸、盐与水分。

4.              测定方法的检出限

首先在对实际送检水样进行喹诺酮类抗生素测定前，应当先以喹诺酮类抗生素为检出相，制配喹诺酮类抗生素的标准溶液。将试验前准备浓度为100mg/L的喹诺酮类抗生素标准储备液，加入制配比例为15：89的甲醇-甲酸比例溶液，，标准溶液中喹诺酮类抗生素含量为100μg/L。而后将上述溶液分别在萃取仪与联用仪上实际测试，得到分析结果，固相萃取样本导柱中的离子反应面积越大

，则说明送检样本的配喹诺酮类抗生素含量越高，而通过计算在色谱样本中的标准物质离子反应程度，就可以直接推算出这种四级杆质谱联用法的检出限。

5.              测定试验结果

得出三重四级杆质谱联用法的最低检出限后，首先向装有去离子水的空白样本加入10μg标准溶液，而后再向装有待测水样的柱管内加入100μg标准溶液，采用外标一点法对样本进行加标回收测定。这种方法思路是利用空白样本中加入喹诺酮类抗生素标准物质的对照品溶液浓度，对比测定出待检水样中的标准物质含量，在Agilent 7000B GC/MS Triple Quad液相色谱三重四级杆质谱联用仪上进行不少于5次的多次进样，通过可视化屏幕得出对照品溶液与待测样本溶液的峰面积，进而推算出待测水样中标准物质的含量浓度。被测水样的浓度计算公式为如下：

其中Wi表示为被测水样中含有喹诺酮类抗生素标准物质的浓度含量;Ai表示为对照样本中含有标准物质的浓度含量;（Wi）s与（Ai）a分别表示为在样本柱管中相同进量体积的被测样本与对照样本中含有纯品喹诺酮类抗生素标准物质的组分重量，用样本峰面积来表达。为了降低外标定量法的误差影响，试验中选择将5组联用仪的进样示数，去除最高值与最低值后，进行平均值计算。得出被测水样如下加标回收实验结果：

原被测水样中NOR物质的测定值为7.4μg/L，样本加标质量为10μg，平均回收率为92.8%，相对标准偏差（RSD）为8.7%;OFL物质测定值为1.5μg/L，样本加标质量为100μg，平均回收率为93.1%，RSD偏差为8.1%;ENR物质测定值为1.6μg/L，样本加标质量为10μg，平均回收率为87.5%，RSD偏差为9.9%。

结语：综上所述，采用超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法，进行NOR、OFL与ENR三类喹诺酮类抗生素标准物质含量测定，可以在6min以内得出被检样本中喹诺酮类抗生素物质的含量分析数据，可以基本保证检出限在0.3-0.7μg/L精度范围之间，在测定试验中发现三种被测物质的加标回收率均在87.5%以上，相对标准偏差不高于10%，测定精度符合飞克检测限水平要求。借助联用仪来进行色谱-质谱固相萃取比对的方法，不仅不需要传统免疫法那样较长的样本分析时长，而且在测定精度上具有一定保障，且具有操作简便、绿色环保的方案优势，因此可以被环保行业和相关水质监管部门广泛应用于畜牧业含喹诺酮类抗生素的水质检测项目上。

参考文献：

[1]孔瑜. β-内酰胺类抗生素废水有机物污染特征和筛查研究[D].上海第二工业大学.

[2]于洋洋. 伊通河流域抗生素污染、微生物耐药性及生物毒性研究[D].东北师范大学.

[3]车先阁. 喹诺酮类抗生素残留的三维荧光光谱检测技术研究[D].燕山大学.