法夫酵母高产虾青素发酵工艺的建立

梁玲玲，徐作武，卢越巧，杨一恭，刘燕，邵东，陈克杰 (浙江医药股份有限公司新昌制药厂，浙江 绍兴 312500)

0 引言

虾青素 (Astaxanthin)被誉为“超级维生素E”，在延缓衰老，提高免疫，防治肿瘤、心血管疾病和糖尿病等方面有显著作用[1]。虾青素微生物生产系统已成为现今主要的商业生产方式，相比不同虾青素生产菌株，法夫酵母具有以下优势：(1) 无需光照，不受地理限制，易于产业化；(2) 可利用多种糖进行快速异养代谢、培养时间短[2]；(3) 菌体浓度高，进一步提升潜能大；(4)非转基因，且已获中国农业部和美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准用作动物饲料添加剂，安全可靠[3-4]。本研究围绕菌浓和产量这两个基本出发点，以本司保藏的高产菌株法夫酵母XC3015为研究对象，采用正交试验设计方法对发酵配方进行优化，在补料摇瓶上考察碳源补加工艺，并在70 L发酵罐上进行新工艺验证，初步建立了适合该菌株的虾青素高产工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

法夫酵母 (Phaffia rhodozyma) XC3015

1.2 实验方法

(1) 培养基的配制

固体培养基：YM培养基，成份参考文献[5]，加入20 g/L琼脂，调pH值为6.0，121 ℃灭菌30 min。种子培养基：YM培养基，调pH值为6.0，121 ℃灭菌30 min。

初始发酵基础培养基：葡萄糖 7.5 g/L、麦芽糊精 7.5 g/L、糖 蜜 5.0 g/L、(NH4)2SO43.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl2·2H2O 0.1 g/L、酵母抽提物 1.0 g/L、乳酸 5.0 g/L、维生素溶液1 mL/L、金属溶液 1 mL/L、泡敌 0.1 g/L，调pH值为6.0，121 ℃灭菌30 min。

维生素溶液：泛酸钙 5.2 g/L、生物素 0.13 g/L、 肌醇 66.67 g/L、尼克酸 5.2 g/L、对氨基苯甲酸 0.53 g/L、VB62.67 g/L、VB12.67 g/L、核黄素 5.2 g/L。金 属 溶 液：H3BO32.67 g/L、CuSO4·5H2O 1.6 g/L、KI 0.27 g/L、MnCl2·4H2O 2.70 g/L、Na2MoO4·2H2O 1.07 g/L、ZnSO4·7H2O 24 g/L、CoCl2·6H2O 0.8 g/L、柠檬酸铁 24 g/L。发酵补糖培养基：葡萄糖 175 g/L、麦芽糊精 175 g/L、糖蜜 50 g/L，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。

(2) 培养方法

固体培养：取-80 ℃冰箱保藏的冷冻甘油保藏液，融化后稀释适当倍数取0.1 mL涂布平板，平板置于20.5 ℃下恒温培养5~7天。种子瓶培养：用接种环挑取生长良好的单菌落，接种种子培养基 (10 mL/50 mL试管)，于20.5 ℃、200 r/min条件下振荡培养48 h，获得成熟一级种子培养液。取2.5 mL一级种子培养液二次接种子培养基 (22.5 mL/250 mL 三角瓶)，于20.5 ℃、200 r/min条件下振荡培养36 h，获得成熟种子瓶培养液。发酵瓶培养：取成熟种子瓶培养液按10%接种比例接发酵培养基(45 mL /650 mL三角瓶)，于20.5 ℃、200 r/min条件下振荡培养120 h，放瓶。补料摇瓶培养：取成熟种子瓶培养液按10%接种比例接发酵培养基 (250 mL/1 000 mL补料摇瓶)，发酵过程中根据程序设计自动补加碳源，控制pH值为5.00±0.02，在通气比1 vvm、温度20±0.5 ℃、转速 220 r/min条件下振荡培养165~175 h。30 L种子罐培养：取二级成熟种子瓶培养液，按1.0%接种比例接种子培养基 (20 L/30 L种子罐)，于温度20.5±0.2 ℃、搅拌转速350 r/min、通气量比1.5 vvm、罐压0.06 MPa条件下培养40 h。70 L发酵罐培养：将成熟种子罐培养液按10%移种比例移发酵罐 (25 L/70 L发酵罐)，培养温度20.5±0.2 ℃、通气比0.6～1.5 vvm、罐压0.06 MPa，全程用25%～28%氨水控制pH值为5.00±0.02，搅拌转速与溶氧联动，关联值为40%。定期取样测定菌浓、碳源浓度和虾青素产量。

(3)发酵优化方法

发酵培养基摇瓶正交优化：选取酵母抽提物、碳源 (葡萄糖：麦芽糊精：糖蜜=3:3:2)、蛋白胨、(NH4)2SO4、微量元素 (维生素溶液：金属溶液=1:1)、乳酸和KH2PO4这7种主要培养基组份，作为正交试验设计的因素。试验采用7因素3水平正交试验L18(37)，分析它们对虾青素产量的影响。

(4)测定方法

菌体浓度检测：对发酵液进行适当稀释，测定波长600 nm处吸光度，根据光密度与细胞干重 (g/L) 的比值为2.50±0.10，确定细胞干重。

虾青素HPLC法检测：取1 mL发酵液，12 000 r/min 离心3 min，去离子水洗涤3次，离心获得菌体。用二甲亚砜 (DMSO) 法破壁，由丙酮抽提至菌体为白色，用容量瓶定容、稀释至适当倍数，使用参考文献[6]的HPLC法，测定虾青素含量。

总糖/还原糖检测：按照菲林试剂法测定[7]。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基摇瓶正交试验优化

根据已报道的培养基组份优化[8-9]和前期本司关于大宗碳源筛选的试验结果，为综合考察多种因素对法夫酵母XC3015发酵产虾青素的影响，选取酵母抽提物、微量元素 (维生素溶液∶金属溶液=1∶1)、碳源 (葡萄糖∶麦芽糊精∶糖 蜜=3∶3∶2)、(NH4)2SO4、蛋 白 胨、乳 酸 和KH2PO4这7种主要培养基组份，采用7因素3水平正交表L18(37) 进行水平组合处理设计，正交试验数据分析如表1所示。

由表1实验结果表明，在所设定的试验条件下，各因素影响虾青素产量水平的主次顺序为：A>C>E>D>B>G>F，即碳源>酵母抽提物>乳酸>(NH4)2SO4>蛋白胨>KH2PO4>微量元素，虾青素生产的优选发酵条件为A2B1C2D3E1F3G2，即 (g/L)：碳源 30，蛋白胨 1，酵母抽提物 3，(NH4)2SO47，乳酸 3，微量元素 12.5 mL，KH2PO41.0，最高虾青素产量为47.5±0.32 μg/mL。

表1 法夫酵母XC3015发酵生产虾青素正交试验结果

2.2 补料摇瓶补糖工艺优化

补料摇瓶补糖工艺优化：校正补料泵的补料速率，设置补料时间和补料间隔实现定时定量补加。补糖1、补糖2、补糖3和补糖4，于24 h开始补加40%碳源，补糖间隔分别为4 h、8 h、12 h和16 h，单次补糖浓度(相对于起始体积，下同)分别为10 g/L、20 g/L、30 g/L和40 g/L，补糖总量(相对于起始体积，下同)均为360 g/L。补糖5、补糖6、补糖7和补糖8，于24 h开始分别补加26.7%、33.3%、46.6%和53.3%碳源，补糖间隔分别为6.0 h、4.8 h、3.4 h和3.0 h，单次补糖浓度均为10 g/L，补糖总量分别为240 g/L、300 g/L、420 g/L和480 g/L。

根据上述发酵培养基摇瓶实验结果及关于碳源浓度、补糖控制和法夫酵母克勒勃屈利效应 (Crabtree effect) 对法夫酵母虾青素生产影响的相关报道提示，必须对法夫酵母发酵过程补糖浓度、补糖总量等关键工艺参数进行考察。为此，在更接近于发酵罐培养模式的补料摇床上设置初始糖浓均为30 g/L，采用8种不同补糖方式考察碳源补加次数、补加时间和补加总量对法夫酵母产虾青素的影响，结果如图1所示。

从图1可知，在补糖总量相同的条件下，补糖间隔越短、单次补糖浓度越低，法夫酵母的菌体浓度和虾青素产量越高，在单次补糖浓度为10 g/L，补糖总量为360 g/L时，菌体干重和虾青素产量分别为72.8±0.7 g/L和233.4±3.1 μg/mL，较单次补糖浓度40 g/L，补糖总量360 g/L时，分别高30.9%和45.41%。设定单次补糖浓度为10 g/L时，随着补糖总量的增加法夫酵母菌体干重和虾青素产量提高，但补糖总量超过420 g/L时菌体干重和虾青素产量明显下降。因此，补料摇瓶中较佳的补糖总量为420 g/L。

图1 补糖方式和补糖总量对法夫酵母虾青素生产的影响

2.3 70 L发酵罐工艺验证

将三角瓶获得的发酵培养基优化配方和补料摇瓶上补糖实验结果在70 L发酵罐上进行发酵工艺验证。比较优化前后法夫酵母菌体干重、虾青素产量、干菌体虾青素含量等相关参数，结果如表2所示。

表2 70 L发酵罐法夫酵母发酵工艺验证

比较法夫酵母70 L发酵罐发酵工艺优化前后虾青素生产实验结果可以得出，优化后法夫酵母菌体干重达到107.7±1.6 g/L，较优化前提高15.4%，虾青素产量达到515.6±2.4 μg/mL，较优化前提高31.9%，干菌体虾青素含量达到4.78 mg/g(细胞干重)，较优化前提高14.1%，耗糖总量较优化前降低14.3%。

3 结语

试验考察的7个影响法夫酵母虾青素生产的因素按主次顺序以及影响由大到小排列为：碳源>酵母抽提物>乳酸>(NH4)2SO4>蛋白胨>KH2PO4>微量元素。在补料摇瓶上优化的补糖工艺为单次补糖浓度10 g/L，补糖总量为420 g/L。将上述获得的发酵配方和补料工艺在70 L发酵罐上进行验证，虾青素产量达到515.6±2.4 μg/mL，较优化前提高31.9%。