miRNA调控细胞焦亡及参与糖尿病肾病作用机制的研究进展

谭桂湘，邹大威,2

(1.首都医科大学，北京 100069; 2.首都医科大学中医药学院，北京 100069)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最重要的慢性并发症之一[1]，也是全世界终末期肾病的主要原因[2]。近10年DN发病率呈现逐渐升高趋势[3]，严重危害患者健康，但DN发病机制尚未完全阐明，临床治疗措施十分有限。细胞焦亡由Cookson和Brennan[4]于2001年提出，是一种促炎程序性细胞死亡。与其他细胞死亡相比，细胞焦亡的主要特点包括胱天蛋白酶(caspase)依赖性、在胞内形成炎症小体和伴随大量炎症介质释放等[5]；在形态学上，细胞焦亡主要表现为细胞膜破裂、染色质断裂和核浓缩等。细胞焦亡参与多种疾病的发生发展[6-8]。近年研究表明，细胞焦亡可通过诱导炎症加重DN肾脏损伤[9-10]。因此，调控细胞焦亡可能成为防治DN的新策略。

微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一类内源性非编码小RNA分子，主要通过功能基因的转录后调控参与多个生理过程[11]。研究显示，miRNA对细胞焦亡的调控在多种疾病的进展中发挥重要作用[12-14]，且miRNA与细胞焦亡关系密切，但关于miRNA通过相关信号通路调控细胞焦亡的机制仍处于研究阶段。另外，诸多文献已报道miRNA在DN中异常表达并可通过氧化应激、免疫炎症、细胞自噬等机制调节DN[15-16]。现通过查阅近年文献，对miRNA调控细胞焦亡的分子机制，以及miRNA调控细胞焦亡参与DN进展的作用机制进行综述。

1 miRNA概述

miRNA是一种由20～24个核苷酸组成的内源性非编码单链RNA分子，具有组织特异性、进化保守性、表达阶段性和基因簇集性等生物学特征，动物源性miRNA的基本合成加工过程首先是在细胞核中转录合成miRNA初级转录产物，之后其产物在Drosha酶的RNA水解酶作用下切割形成前体miRNA，再在转运蛋白作用下移至细胞质中，并在Dicer水解酶作用下进一步切割产生成熟的miRNA[17-18]。成熟miRNA主要通过结合到信使RNA的3′端非翻译区，对信使RNA进行剪切和降解,或者通过在转录后水平上抑制蛋白质翻译来控制靶基因的表达。miRNA是机体重要的调节因子,至少60%的人体蛋白质编码基因表达受到miRNA的调控，除此之外，miRNA在多个生物学过程中发挥重要作用和功能，如细胞增殖、分化、迁移、凋亡、癌变、血管生成、胰岛素分泌、胚胎组织发育等。研究显示，miRNA参与调控多种疾病的发生发展和转归，如糖尿病、胃癌、慢性心力衰竭等，并可作为这些疾病的有效治疗靶点[12-14]。

2 miRNA调控细胞焦亡的机制

细胞焦亡受到多种因素直接或间接的调控，并且存在多条作用途径，目前研究显示对细胞焦亡的调控作用集中于对焦亡信号通路中关键靶蛋白的调节。根据其发生机制，细胞焦亡可分为caspase-1依赖型的经典焦亡通路和caspase-4/5/11依赖型的非经典细胞焦亡通路。在经典途径中，模式识别受体与含caspase募集域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)共同作用招募caspase-1前体，组成炎症小体[主要包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)1、NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2等][19]，进而激活caspase-1[20]，活化的caspase-1可激活消化道皮肤素D(gasdermin D，GSDMD)[21]，释放其活性N端结构域在细胞膜上成孔，导致细胞焦亡，同时将活化caspase-1激活的白细胞介素(interleukin，IL)-18和IL-1β等炎症介质释放到胞外，诱导炎症反应。在非经典途径中，人体内caspase-4/5前体和小鼠体内caspase-11前体在结合细菌脂多糖后发生寡聚而活化[22]，活化的caspase-4/5/11可激活GSDMD、IL-18与IL-1β，在膜上打孔并释放出细胞内容物，细胞发生焦亡。研究证实miRNA参与调控细胞焦亡，其主要作用机制与焦亡通路中相关分子密切相关，如NLRP3炎症小体、ASC、GSDMD等，除此之外，miRNA还可与其他调节因子以及长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)相互作用，共同调节细胞焦亡[23]。

2.1miRNA通过调节焦亡通路相关分子表达直接调控细胞焦亡 在细胞焦亡通路中，ASC、caspase-1、NLRP3、GSDMD等分子表达水平升高既是细胞焦亡发生的主要特征，又是细胞焦亡发展的必要条件，通过靶向调节这些分子的表达，miRNA可直接调控细胞焦亡。Gu等[24]证实高糖可诱导人视网膜微血管内皮细胞发生细胞焦亡，其中miR-590-3p表达下降，NLRP1表达增加，荧光素酶报告实验证实miR-590-3p可靶向作用于NLRP1。该模型中转染miR-590-3p抑制剂可增强细胞焦亡，转染miR-590-3p模拟物可减轻细胞焦亡。转染干扰小RNA NLRP1后，再转染miR-590-3p模拟物不能继续降低细胞焦亡率，表明miR-590-3p可通过靶向NLRP1调节高糖诱导的细胞焦亡。Long等[25]发现在梅毒患者中miR-223-3p表达降低，caspase-1和IL-1β表达上调，同时发现膜免疫原rTp17可以诱导T苍白球感染人脐静脉内皮细胞(T pallidum-infected human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)焦亡，并通过给HUVECs转染miR-223-3p抑制剂和模拟物，证实miR-223-3p可以抑制炎症小体激活和细胞焦亡。通过荧光素酶实验报告和过表达/敲减NLRP3的实验，证实miR-223-3p可靶向调控NLRP3抑制细胞焦亡。Li等[26]用亚砷酸盐诱导人肝细胞焦亡，细胞中miR-379-5p表达降低，GSDMD和裂解的caspase-1水平升高，1L-1β释放增加，肝细胞转染miR-379-5p模拟物使miR-379-5p过表达后，细胞中GSDMD和裂解的caspase-1表达降低，1L-1β释放减少，细胞焦亡被抑制，结合荧光素酶报告基因检测显示GSDMD是miR-379-5p的直接靶标，证实miR-379-5p通过降低GSDMD表达抑制细胞焦亡。Han等[27]证实miR-22也可通过抑制GSDMD表达，进而抑制细胞焦亡。

2.2miRNA与调节焦亡的细胞因子相互作用发挥间接调控作用 许多分子如叉头框转录因子O1(forkhead box O1,FoxO1)、A20蛋白、细胞因子信号转导抑制物1(suppressors of cytokine signaling-1，SOCS-1)等虽然没有直接参与焦亡通路，却可作为调节因子参与细胞焦亡的调控，miRNA也能与这些调节因子相互作用，间接调控细胞焦亡。研究发现FoxO1可通过降低miR-148A表达，促进NLRP3炎症小体激活，进而促进细胞焦亡[28]。Zeng等[29]用1-甲基-4-苯基-吡啶离子诱导人神经母细胞瘤细胞和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞焦亡，细胞中FoxO1表达升高，而miR-135b表达降低，过表达miR-135b后，细胞焦亡相关分子(如NLRP3炎症小体、caspase-1和IL-1β)的表达被抑制，过表达FoxO1后可解除miR-135b对细胞焦亡的抑制作用，结合荧光素酶报告基因检测显示FoxO1是miR-135b的下游靶标，表明miR-135b通过作用于FoxO1抑制细胞焦亡。A20蛋白是炎症信号转导的中枢调节因子，可发挥抗炎作用。Ding等[30]采用高糖干预巨噬细胞源性内皮细胞与小鼠足细胞共培养诱导足细胞焦亡模型，其中miR-21-5p表达升高，过表达miR-21-5p后，A20蛋白表达减少，焦亡相关分子水平升高，根据荧光素酶报告基因检测显示A20是miR-21-5p的作用靶点，给实验细胞转染miR-21-5p抑制剂后，A20表达升高，焦亡相关分子水平下降，通过抑制A20表达，则可以消除这些影响，证实miR-21-5p通过靶向抑制足细胞中A20表达，促进焦亡相关分子表达，进而促进足细胞焦亡。此外，Xue等[31]研究证实A20是miR-21的直接靶点，敲除miR-21后，A20表达增加，抑制了NLRP3炎症小体介导的caspase-1激活和IL-1β的分泌，ASC寡聚和再分配，以及GSDMD的裂解，进而抑制细胞焦亡。已证实SOCS-1可通过信号转导及转录活化因子途径抑制炎症反应[32]，而miR-155可抑制SOCS-1的表达[33]。Li等[34]发现牙龈卟啉单胞菌可诱导巨噬细胞焦亡，细胞中miR-155表达显著增加，而SOCS-1的水平降低，通过转染短发夹miR-155使miR-155沉默后，SOCS-1表达增加，而细胞焦亡相关分子(NLRP3炎症小体、IL-1β和IL-18等)表达均降低，表明miR-155通过抑制SOCS-1表达促进细胞焦亡。

2.3miRNA与lncRNA共同调控细胞焦亡 lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，在表观遗传学、转录前、转录和转录后水平上调节基因表达[35]。已发现的lncRNA在多种生物过程中起关键作用，如细胞增殖、凋亡、迁移、自噬和炎症等，同时研究证实lncRNA参与调控细胞焦亡，而miRNA与lncRNA也能共同影响细胞焦亡[36]。Song等[37]用一水草酸钙诱导人近端肾小管上皮(human kidney-2，HK-2)细胞焦亡，细胞中lncRNA LINC00339表达升高，miR-22-3p表达降低。过表达lncRNA LINC00339后可显著提高HK-2细胞焦亡相关分子表达，而转染miR-22-3p模拟物可起到相反的作用。lncRNA LINC00339可通过海绵吸附解除miR-22-3p对NLRP3炎症小体的抑制，促进HK-2细胞焦亡。Mao等[38]研究发现，lncRNA Krüppel样因子3反义RNA 1可通过下调miR-138-5p表达，降低NLRP3、ASC、裂解的caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18水平，进而抑制心肌细胞焦亡。Liang等[23]研究发现，lncRNA 母系表达基因3可靶向结合miR-485，提高黑色素瘤缺乏因子2炎症小体表达，进而促进ASC、caspase-1和GSDMD的表达，诱导神经细胞焦亡。

3 miRNA调控细胞焦亡参与DN进展

细胞焦亡在DN的发生发展中起着重要作用[39]。目前认为，NLRP3炎症小体/caspase-1/GSDMD通路是调节DN进展的细胞焦亡相关通路，如NLRP3炎症小体的活化启动了炎症级联反应、caspase-1介导了肾脏组织的损伤等。因此，调控细胞焦亡经典通路已成为防治DN的新热点。DN的临床表现包括肾小球滤过率下降、蛋白尿、肾功能进行性衰退，并最终发展为肾衰竭，其基本病理特征为肾小管间质纤维化、细胞外基质积聚、基膜增厚、肾小球肥大、肾小球系膜扩张等[40]。miRNA可通过调控DN肾脏固有细胞焦亡和炎症反应，参与DN进展。

3.1肾小管上皮细胞 肾小管上皮细胞的损伤在DN早期已经出现，并与DN的后期进展密切相关[41-42]。Xie等[39]用高糖诱导HK-2细胞焦亡，细胞中NLRP3炎症小体、caspase-1、IL-1β、GSDMD-N、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和miR-452-5p的表达升高，而lncRNA 生长阻滞特异性转录因子5(growth arrest-special transcript 5,GAS5)表达降低，在HK-2细胞转染GAS5质粒或miR-452-5p的抑制剂后，lncRNA GAS5表达增加，miR-452-5p表达降低，细胞焦亡被抑制，结合荧光素酶报告基因检测分析显示lncRNA GAS5可靶向抑制miR-452-5p表达。因此，通过升高lncRNA GAS5的表达或者降低miR-452-5p的表达，可以抑制HK-2细胞焦亡和炎症反应，进而延缓DN进展。

但是，同一个靶细胞往往受到多种miRNA的调控，而不同miRNA的作用往往不同甚至相反，如虽然miR-452-5p可以促进HK-2细胞焦亡，但是Zhu等[43]证实miR-506-3p可以抑制HK-2细胞焦亡和炎症反应；Wang和Zhao[44]研究发现由于INK4基因座反义非编码RNA(antisense non coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)解除了miR-497对硫氧还蛋白互作蛋白的抑制，NLRP3炎症小体和caspase-1表达增加，促进HK-2细胞焦亡；Li等[45]研究发现lncRNA肺腺癌转移相关转录本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，MALAT1)可解除miR-23c对类胚胎致死性异常视觉基因1的抑制，促进NLRP3炎症小体表达，促使HK-2细胞焦亡；Liu等[46]发现，在HK-2细胞焦亡中，lncRNA MALAT1对于miR-30c的抑制也起着重要作用。此时，若要通过抑制HK-2细胞焦亡治疗DN，就要上调这些miRNA的表达水平，并抑制某些lncRNA的表达。

3.2足细胞 足细胞损伤是DN的最初标志之一，在DN发展中起重要作用[47]。Zuo等[48]用高糖诱导小鼠足细胞焦亡，细胞中caspase-1、GSDMD、NLRP3表达提高，lncRNA MALAT1和miR-200c-3p表达也升高，MALAT1基因敲除和miR-200c-3p干扰均可抑制高糖诱导的小鼠足细胞的焦亡，因此通过抑制lncRNA MALAT1和miR-200c-3p的表达，可对防治DN起到一定效果。此外，miR-21-5p可通过靶向抑制足细胞中A20表达，促进焦亡相关分子的表达，进而促进足细胞焦亡，加快DN进展[30]。

3.3肾系膜细胞 肾系膜细胞肥大、增殖和细胞外基质堆积是DN重要的病理标志[49]。李嵘等[50]用高糖诱导人肾系膜细胞焦亡，细胞中miR-497的表达显著降低。给肾系膜细胞转染miR-497模拟物使miR-497过表达后，细胞中IL-1β、TNF-α和caspase-1表达降低，细胞焦亡被抑制。通过生物信息学预测和荧光素酶报告基因检测分析显示，miR-497可直接靶向作用于NLRP1炎症小体基因，同时根据蛋白质免疫印迹杂交结果显示miR-497可抑制NLRP1炎症小体表达，通过给细胞转染NLRP1质粒使NLRP1炎症小体过表达后，可解除miR-497对细胞焦亡的抑制作用，表明miR-497通过靶向抑制NLRP1炎症小体表达，减少caspase-1表达和炎症介质分泌，进而抑制肾系膜细胞焦亡与炎症反应，延缓DN进展。Zhan等[51]用高糖溶液诱导大鼠肾系膜细胞焦亡，发现lncRNA 核富集转录体1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1)可通过靶向抑制miR-34c表达，促进NLRP3炎症小体表达，进而促进大鼠肾系膜细胞焦亡和炎症反应，加快DN进展，此时通过提高miR-34表达或抑制lncRNA NEAT1表达，可达到治疗效果。

4 小 结

DN发病率高且预后差，即便使用目前最佳治疗方案也不能完全防止DN患者发展到终末期肾病，因此需要进一步揭示DN发病机制。细胞焦亡是一种新发现的程序性细胞死亡，可作为机体的自我保护反应参与有害物质的清除，但过度的细胞焦亡会导致机体紊乱，诱发多种疾病。目前，高糖、脂代谢异常、氧化应激等DN危险因素对于细胞焦亡影响的研究，以及药物干预调控焦亡抑制DN进展的研究，预示着通过细胞焦亡治疗DN有望取得突破。miRNA的差异表达与多种疾病的发生、发展密切相关，其中miRNA对于细胞焦亡的调控起着重要作用。相关研究表明，miRNA对于细胞焦亡的调控主要集中于对焦亡通路中相关靶分子表达的调节，并能与多种调节因子以及lncRNA共同作用于细胞焦亡。另外，miRNA可通过调控DN肾脏固有细胞焦亡和炎症反应参与DN进展，但miRNA的作用具有广泛性和多样性等特点，不同miRNA对于人体的影响还须更多实验去验证。相信随着对细胞焦亡机制的进一步研究，以及更多miRNA靶点的发现，通过miRNA调控细胞焦亡来防治DN将会成为临床治疗DN以及新药研发的重要思路。