转录因子核因子κB和IKK在慢加急性肝衰竭中的临床诊断价值

袁慧姣 韩 波

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure,ACLF）是临床常见的一种肝脏衰竭疾病，是肝衰竭中常见的类型，多由慢性肝炎发展而来，其进展迅速，病情危重，预后不良，病死率极高，目前，尚无治疗ACLF的特效药和方法，现临床上多采用抗病毒、免疫调节等传统疗法，但病毒的耐药性等因素使治疗效果不能让人满意，临床上虽有肝移植、人工肝替代治疗等新型技术，但存在供体短缺、价格昂贵、并发症多等弊端[1]。该疾病受多种信号通路调节，目前研究发现，STING-IRF3信号通路对ACLF的发生[2]、进展具有重要的调控作用，核因子κB和IKK是STING-IRF3信号通路中重要的转录因子[3-4]，两者功能的发挥依赖于转录后的反应修饰（post-transcriptional modification, PTM），通过磷酸化的修饰使蛋白具有活性进而发挥生物学功能[5-7]。本研究就核因子κB和IKK蛋白在ACLF中的表达情况以及其与患者临床特征和预后相关性进行分析。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3月至2018年11月于辽宁中医药大学附属医院治疗的144例ACLF患者作为研究对象，其中男100例，女44例，年龄20～62岁，平均（40±6.32岁）。

纳入标准：1）符合ACLF诊断标准[8]；2）行手术治疗且术后经病理检查确诊；3）签署了知情同意书。排除标准：1）除ACLF外还存在其他肝功能障碍；2）临床以及随访资料不完整。

1.2 方法

收集144例ACLF患者的各项临床资料，手术过程中收集的肝组织标本和日常的血液、尿液作为试验组。同时收集144例正常人的血液、尿液以及肝脏组织作为对照组。比较两组核因子κB和IKK蛋白的磷酸化水平以及表达量，分析核因子κB和IKK蛋白的磷酸化水平和表达量与ACLF临床病理特征的关系。对144例ACLF患者进行为期4年的回访，随访方式包括电话随访、微信随访、回院复查等，比较核因子κB和IKK蛋白不同表达水平4年的生存率。采用Logistic多因素回归分析影响ACLF患者预后死亡的相关因素。

1.3 检测与评价

鼠抗人的核因子κB多克隆抗体、鼠抗人的p-核因子κB多克隆抗体、兔抗人的IKK多克隆抗体、兔抗人的p-IKK多克隆抗体和鼠抗人的actin多克隆抗体均购自于美国Cell Signaling Technology公司，蛋白裂解液及蛋白质免疫印迹法跑胶仪、转膜仪和化学发光仪购自广州天能公司，ECL-化学发光液购自美国密理博公司，对不同试验组的蛋白质免疫印迹法检测的蛋白条带的灰度进行量化，当试验组中核因子κB和IKK蛋白的灰度值高于对照组，则判定结果为阳性；反之则为阴性（不同试验组中的内参蛋白actin的灰度值为一致），严格按照试剂盒中的说明书与试验规范手册进行相关试验操作。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；采用Logistic多因素回归分析影响ACLF患者预后死亡的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组各样本核因子κB蛋白表达量与磷酸化水平比较

对照组与试验组比较，核因子κB蛋白表达量不变（P＞0.05），而p-核因子κB蛋白表达量明显减少（P＜0.05）。见图1，表1。且在144例ACLF患者中，肝组织p-核因子κB蛋白阳性95例，表达率为65.9%高于对照组中仅存的5例（χ2=24.759，P＜0.05），血清p-核因子κB蛋白阳性102例，表达率为70.8%高于对照组中的8例（χ2=36.191，P＜0.001），尿液中p-核因子κB蛋白阳性96例，表达率为66.7%高于对照组中的6例（χ2=29.178，P＜0.001）。

表1 两组各样本中核因子κB蛋白表达量与磷酸化水平比较

图1 两组各样本中核因子κB蛋白表达量与磷酸化电泳结果

2.2 两组各样本中IKK蛋白表达量与磷酸化水平比较

无论在肝脏、血液还是尿液中，试验组中IKK与p-IKK蛋白表达量明显高于对照组（P＜0.05）。见图2，表2。在144例ACLF患者中，肝组织IKK蛋白阳性84例，表达率为58.3%高于对照组中的6例（χ2=33.075，P＜0.001），血清IKK蛋白阳性96例，表达率为66.7%高于对照组中的8例（χ2=38.284，P＜0.01），尿液中IKK蛋白阳性91例，表达率为63.2%高于对照组中的5例（χ2=25.793，P＜0.01）；肝组织p-IKK蛋白阳性112例，表达率为77.8%高于对照组中的4例（χ2=17.043，P＜0.05），血清p-IKK蛋白阳性89例，表达率为61.8%高于对照组中的5例（χ2=26.342，P＜0.05），尿液中p-IKK蛋白阳性100例，表 达率为69.4%高于对照组中的6例（χ2=19.012，P＜0.05）。

表2 两组各样本IKK表达量与磷酸化水平

图2 两组各样本IKK蛋白表达量与磷酸化水平电泳结果

2.3 144例ACLF患者预后情况

随访4年结束后，核因子κB和IKK蛋白表达均为阳性患者4年生存率为5.89%（5/80）；核因子κB蛋白表达为阳性，IKK蛋白表达为阴性的患者，其4年的生存率为20.12%（18/92）；核因子κB蛋白表达为阴性，IKK蛋白表达为阳性的患者，其4年的生存率为25.18%（14/52）。不同核因子κB和IKK蛋白表达水平的ACLF患者5年生存率比较差异有统计学意义（P＜0.001），且经非条件多因素Logistic回归模型结果显示：核因子κB蛋白（阳性）、IKK蛋白（阳性）以及病理学Ⅲ期为影响ACLF患者预后的独立危险因素（P＜0.001）。见表3。

表3 影响ACLF患者预后单因素和多因素分析结果

3 讨论

STING-IRF3作为一类常见的信号通路，主要参与机体的免疫应答反应，STING能识别机体的外源性DNA，识别后通过招募TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1, TBK1）和干扰素调节因子（interferon regulatory factor, IRF）-3形成复合物后，该复合物由细胞质转移到细胞核中，与细胞核中能识别IRF-3的目的基因的反应元件结合，促进炎症基因的表达，如核因子κB蛋白、IKK蛋白[9-11]。本研究中通过检测144例ACLF患者的肝组织、血液和尿液中STING-IRF3通路的下游转录因子核因子κB蛋白、IKK蛋白的磷酸化水平发现，患者体内核因子κB蛋白、IKK蛋白的磷酸化水平明显上升，导致机体免疫应答反应减弱，无法正常抵御外来病原体的入侵。

核因子κB蛋白、IKK蛋白作为炎症介质，参与多种信号通路的转导。核因子κB蛋白最早由David Baltimore发现[12]，当机体受到刺激后，外部的刺激因子与膜受体结合进而激活IKK，活化后的IKK自身发生磷酸化修饰，使得其被泛素小体降解，最终释放核因子κB二聚体，核因子κB自由进入细胞核，结合在目的基因的反应元件区域，启动下游基因的转录表达[13]。刘巧红等[14]的研究发现，通过解毒化瘀通腑颗粒可有效缓解ACLF患者的症状，且患者体内的核因子κB等磷酸化蛋白水平有所下降，其结果从侧面证明了本研究结论的正确性。

综上所述，STING-IRF3通路可通过炎症介质核因子κB、IKK来影响ACLF患者的病情，该蛋白在ACLF中的阳性率明显高于正常对照组。但本研究中发现，ACLF患者体内的IKK蛋白表达量与其磷酸化形式均有所增高，这可能是部分IKK蛋白转化为其自身磷酸化形式，进而行使其生物学功能，其具体的转化机制可能还需要更进一步的研究。