儿童急性淋巴细胞白血病中RAS基因突变的检测及其临床意义

姚燕玲 王西阁 赵雪莲 李帅全 周玉洁 徐一卓

（郑州大学第三附属医院血液科，河南郑州 450052）

RAS信号通路控制着细胞增殖、分化与凋亡，当RAS基因突变时，细胞非依赖性增殖，转变为癌细胞［1-2］。RAS基因编码RAS蛋白，RAS蛋白分别与二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）、三磷酸鸟苷（guanosine triohosphate，GTP）结合，将促进生长的信号从细胞膜传递到细胞核，起到细胞“开关”的作用。生理情况下，鸟嘌呤核苷酸交换因子促进GDP向GTP转换，激活下游通路，使细胞增殖。GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）可提高RAS蛋白的内在GTP酶活性，促进GTP水解为GDP。通过GAP引起的RAS活性失活是RAS等位基因致癌突变中最常见的体细胞突变靶点。RAS基因位点G61的致癌突变降低了RAS蛋白的内在GTP酶活性，而位点G12、G13通过空间位阻阻碍RAS与GAP之间形成范德华键，从而降低GTP水解水平［3-5］。近年来，随着基因测序技术日益精进，RAS基因得到越来越多的关注，如RAS基因突变常作为亚克隆发生在骨髓增生异常综合征疾病晚期；骨髓纤维化疾病中，RAS基因突变常与外周血单核细胞水平升高、血小板计数减低、骨髓原始细胞比例升高等有关，影响该病的总生存（overall survival，OS）率［6-7］。既往研究表明，在急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患儿中，RAS基因突变与药物反应差、低无病生存率、高复发风险有关［8-9］。本研究使用二代测序方法，分析了ALL中RAS基因突变患儿的临床特征和实验室检查，及其对OS率的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性收集2015年1月至2020年1月就诊于郑州大学第三附属医院并完成二代测序的初治ALL患儿120例的临床资料，其中男性65例（54.2%），女性55例（45.8%）。急性B淋巴细胞白血病（acute B lymphoblastic leukemia，B-ALL）105例，急性T淋巴细胞白血病（acute T lymphoblastic leukemia，T-ALL）15例。根据是否存在RAS基因突变分为RAS基因突变组和RAS基因阴性组。

1.2 RAS基因突变的检测

采集初治ALL患儿2 mL骨髓标本，用二代测序法检测RAS基因全外显子序列的单核苷酸变异、小片段插入/缺失，平均测序深度为2 000×，测序后原始数据进行生物信息学分析，筛选致病性基因突变位点。

1.3 免疫学分型

将患儿2 mL骨髓样本放入流式细胞仪中，设门分析异常细胞，应用单克隆抗体对白血病细胞表面抗原进行标记，根据免疫学标志进行分型。

1.4 染色体核型分析

取患儿2 mL骨髓标本放入肝素抗凝管中，进行植物血凝素短期培养后立即制片，收集有丝分裂的骨髓中期细胞，行吉姆萨染色并显带分析，放入染色体分析仪中，分析并描述染色体核型。

1.5 融合基因检测

取患儿2 mL骨髓标本，放入EDTA-K2抗凝管中，TRIzol法提取有核细胞RNA，使用基因扩增仪（杭州博日Life Pro扩增仪）、科研用ALL融合基因检测试剂盒（美国OMEGA公司生产），在多重巢式RT-PCR技术下，检测常见的15种融合基因，包括：MLL/AF4、SIL/TAL1、ETV6/RUNX1、dupMLL、MLL/ENT、E2A/PBX1、SET/CAN、BCR/ABL、TLS/ERG、E2A/HLF、CALM/AF10、HOX11L2、HOX11、MLL/AF10、NPM/ALK。

1.6 随访

随访截止时间为2021年4月30日，通过住院病历、门诊病历和电话获得患儿情况。OS期指自诊断日期至死亡或随访截止日期。

1.7 统计学分析

采用SPSS 26.0软件完成统计学分析。非正态分布计量资料采用中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；计数资料采用例数和百分率（%）表示，率的比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。生存分析用Kaplan-Meier法，采用log-rank法进行单因素分析，将单因素分析中P＜0.1的影响因素纳入Cox风险比例回归模型进行多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAS基因突变情况

120例ALL患儿中，RAS基因突变35例（29.2%），其中仅KRAS基因突变30例（25.0%），NRAS基因突变伴KRAS基因突变5例（4.2%）。RAS基因突变在B-ALL患儿中检出率为33.3%（35/105），未在T-ALL患儿中检出。全部（5/5）NRAS基因突变和57%（20/35）KRAS基因突变均发生于第12号密码子上，14%（5/35）KRAS基因突变发生于第13号密码子上，29%（10/35）KRAS基因突变发生于其他密码子上，未发现第61号密码子突变。

2.2 RAS基因突变组和RAS基因阴性组临床特征比较

RAS基因突变组与RAS基因阴性组在性别、诊断年龄、危险度分型、髓外浸润等方面差异均无统计学意义（P＞0.05）。RAS基因突变组B-ALL比例、染色体核型异常比例高于RAS基因阴性组，初诊白细胞数计数低于RAS基因阴性组（P＜0.05）。见表1。

表1 RAS基因突变组和RAS基因阴性组临床特征比较

2.3 伴RAS基因突变ALL患儿预后的影响因素分析

中位随访时间为18（9，35）个月，失访11例（9.2%）。随访109例ALL患儿中，死亡16例（14.7%）；5例（4.6%）患儿有中枢神经系统复发，其中伴RAS基因突变1例。RAS基因突变患儿2年OS率为54%±13%，低于RAS基因阴性患儿（89%±4%，χ2=5.422，P=0.020）（图1）。35例RAS基因突变患儿中位随访时间17.5（7.5，24.8）个月，失访9例。随访26例患儿中，死亡7例（27%），1例（4%）出现中枢神经系统复发。单因素分析显示，WT1基因过表达、初诊白细胞计数可影响伴RAS基因突变ALL患儿的预后（P＜0.05），见表2。

表2 影响伴RAS基因突变ALL患儿预后的单因素分析

将单因素分析中P＜0.1的影响因素纳入Cox风险比例回归模型进行多因素分析显示，WT1基因过表达、初诊白细胞计数＞50×109/L为伴RAS基因突 变ALL患儿预后不良的影响因素（P＜0.05），见表3。

表3 影响伴RAS基因突变ALL患儿预后因素的Cox风险比例回归模型分析

3 讨论

RAS基因可分为3种：NRAS、KRAS、HRAS基因。Wiemels等［10］的研究中，RAS基因在191例ALL患儿中的检出率为20%。有报道称NRAS基因突变较常见，发生率为6%［8］。RAS基因点突变多见于第12、13、61号密码子［8，11］。本研究中仅KRAS基因突变检出率25.0%（30/120），NRAS基因突变检出率4.2%（5/120），多于第12、13号密码子发生点突变，与上述研究基本相符。

本研究中B-ALL患儿RAS基因突变率高于T-ALL患儿，和Wiemels等［12］研究基本一致，但另一项研究表明RAS基因突变率在B-ALL和T-ALL中无差异［10］。也有研究证实RAS基因突变在早期前体T-ALL中达到三分之二以上，而在非早期前体T-ALL中只有19%［13］。本研究并未在T-ALL中检出RAS基因突变。结果不一致的原因可能有：（1）患儿构成有差异；（2）样本量限制；（3）检测方法不同。既往研究表明，RAS基因突变患儿高危分型比例高于RAS基因未突变患儿［14］，本研究中未得出有差异的结果。英国一项小规模研究纳入86例ALL患儿，结果显示，RAS基因突变与初诊白细胞计数较高等相关［15］。本研究中RAS基因突变患儿初诊白细胞数未明显升高，可能与患儿构成差异造成数据结果偏倚有关。我们分析初诊白细胞计数升高原因可能为：与其他正常儿童细胞相比，RAS基因在外周血白细胞、淋巴细胞和骨髓细胞中相对活化［16］。在超二倍体亚组中，RAS基因突变组的初诊白细胞计数高于RAS基因阴性组；在非超二倍体亚组中，RAS基因突变与初诊白细胞计数无关，这表明RAS基因和高超二倍体之间有极其强烈的关联［12］。Holmfeldt等［17］研究表明，ALL患者中，三分之二以上的单倍体患儿存在RAS基因突变，低亚二倍体和近二倍体患儿则较少发生RAS基因突变。本研究中，RAS基因突变患儿染色体核型多正常。造成结果不同的原因可能是不同队列的患儿构成比不同。

迄今所报道的RAS基因对预后的影响，尚存争议。美国一项纳入870例ALL患者的研究显示，RAS基因突变对无事件生存率、无病生存率或OS率无影响［11］。Zhang等［18］和Irving等［19］研究指出RAS基因突变常与ALL复发有关。但Case等［15］研究表明，儿童ALL诊断和复发时RAS基因突变率相似，意味着RAS基因突变不是ALL复发的危险因素。本研究得出，RAS基因突变可影响ALL患儿的OS率。伴RAS基因突变ALL患儿合并WT1基因过表达、初诊白细胞数计数＞50×109/L时，预后更差。我们分析RAS基因突变影响预后的原因可能有：（1）RAS基因突变多与预后不良基因变异（IKZF1基因缺失、TP53基因突变、FLT3基因突变等）同时发生；（2）RAS基因突变在复发时常见；（3）RAS基因突变患儿对化疗药物耐药。既往研究已证实，伴RAS基因突变的患儿在体外对糖皮质激素的抵抗力更强［20］。在存活率更低的KRAS基因突变细胞中，对长春新碱治疗的敏感性可重复增加，相反，KRAS基因突变细胞对甲氨蝶呤有抗药性，且双KRAS基因密码子点突变的表达比单一KRAS基因密码子点突变的表达诱导了更高水平的MAPK磷酸化和更强的甲氨蝶呤抗药性，所以，MEK抑制剂等相关药物得到了越来越多的关注［21］。

综上所述，本研究表明RAS基因突变患儿多是B-ALL，初诊白细胞计数无明显升高，对化疗药物可能出现耐药性，预后不良。在患儿初治时即完善相关基因突变检查，明确有无RAS基因突变，对是否服用相关激酶抑制剂药物有一定指导意义。但本研究结果仍需要大样本多中心研究进一步证实。