Hedgehog信号通路在恶性胸膜间皮瘤细胞增殖中的作用机制

任心愿，张惠洁

(1.内蒙古医科大学第三临床医学院，内蒙古 包头 014010；2.内蒙古医科大学第三临床医学院内蒙古包钢医院肿瘤内科)

恶性胸膜间皮瘤(Malignant pleural mesothelioma，MPM)是一种在胸膜组织中发生的相对罕见的恶性肿瘤,发病率大约为0.3/10万～0.5/10万[1-2]。资料统计表明，在过去50年中，恶性胸膜间皮瘤的发病率已逐渐上升至所有胸膜肿瘤的5 %[3]。有文献报道[4-6]，人恶性胸膜间皮瘤肿瘤组织、细胞中发现Hedgehog信号通路被激活，Gli1表达升高，Gli1表达高的患者预后差。以Hedgehog信号通路为靶点研发抗肿瘤药物是近年探索热点。Vismodegib是Smoothened(SMO)的蛋白抑制剂，可抑制Hedgehog信号通路传递和功能，现已批准临床用于治疗基底细胞癌[7]。目前Gli1的研究报道较多，发现它可调控血管因皮生长因子(VEGF)等靶基因转录，在肿瘤细胞中，激活后的Hedgehog通路具有促进肿瘤血管生成的作用。Pinter等[8]发现，使用GDC-0449(Hh通路抑制剂)作用肝癌细胞，细胞中Gli1、VEGF基因表达降低，用GDC-0449处理原发性肝癌大鼠模型，大鼠体内VEGF表达水平及微血管密度均下降，生长受到抑制。Chen等[9]在结肠癌小鼠模型中也发现肿瘤基质细胞中Hedgehog通路异常活化，可通过增加VEGF表达，促进血管生成。此外，Gli1被活化后进入细胞核内，引起下游TGF-β1、Wnt基因的激活。Xu等[10]运用cDNA芯片分析出与Gli1调控EMT相关的下游靶基因，并阐明在胰腺癌中Gli1是通过TGF-β1、Ras、Wnt、P13K/AKT等特定的靶基因而调控EMT的作用机制。Hedgehog通路涉及的分子作用机制较复杂，在恶性胸膜间皮瘤中的相关研究较少，我们下面的实验将以此作为依据及基础，通过体外细胞试验，研究抑制Hedgehog信号通路对恶性胸膜间皮瘤细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1主要实验试剂 人恶性胸膜间皮瘤细胞(MSTO-211H)，购自上海弘顺科技公司；Vismodegib，购自美国MCE；培养基及胎牛血清，购自天根；CCK8及PCR试剂，购自takara公司；PCR引物的设计与合成由北京博迈德生物公司完成。

VEGF上游序列 5′-AGTGTGTGCCCACTGAGGA-3′，下游序列 5′-GTGCTGTAGGAAGCTCATCTC-3′

Gli1上游序列 5′-AGACCAACAGCTGCACCGAG-3′，下游序列 5′-TGCCAATGGAGAGATGACCG-3′

Wnt上游序列 5′-TGCCGGACTCTCATGAAC-3′，下游序列 5′-GTGTGGTCCAGCACGTCTTG-3′

TGF-β上游序列 5′-TGGACATCAACGGGTTCACT-3′，下游序列 5′-GCACGATCATGTTGGACAGC-3′

GAPDH上游序列 5′-CCTCAACGACCACTTTGTCA-3′，下游序列 5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3′

1.2细胞培养 对恶性胸膜间皮瘤细胞株MSTO-211H使用已配好的1640完全培养基(含2 %抗生素、10 %血清)培养，置于环境条件为37 ℃、5 % CO2恒温、饱和湿度培养箱中培养。

1.3Vismodegib对MSTO-211H细胞增殖抑制实验 根据前期预实验及相关文献得出药物浓度50 μM和40 μM培养基培养后，显微镜下细胞明显死亡，故从<30 μM浓度开始检测抑制率。选择具有良好状态和密度的一瓶细胞，用胰酶消化细胞后，添加完全培养基，再使用巴氏吸管小心吹打，使样品成单细胞悬液，进行计数。计数结束后，将细胞悬液进行吹打稀释，确保细胞数达到3×104个/mL,按照3×103个/孔接种在96孔板，设置对照组、空白组和观察组，每组设置6个复孔。将96孔板放置在标准培养箱，条件是37 ℃、5 % CO2恒温、饱和湿度，孵育24 h，使用移液器吸取掉原有培养基，96孔板中加入DPBS液在边缘两行，其余由左向右依次加入含Vismodegib终浓度为0、5 、10、15、20、25、30 μM的培养基200 μL，置于培养箱继续孵育。细胞孵育48 h后，使用移液器轻轻吸取并弃掉旧培养基，尽量吸取干净后每孔中加入相同的完全培养基100 μL后，再加CCK8检测溶液10 μL，避光放入标准培养箱中，从30 min开始至1 h，使用酶标仪测定450 nm波长处的OD值，读出结果(取1.0附近的值)。上述实验步骤需要多次重复后得出结果，最少需要三次，计算平均数据，得出IC50值。

1.4提取RNA及Realtime PCR检测细胞MSTO-211H中VEGF、Gli1、wnt、TGF-β的表达差异 提取用半数抑制率浓度培养时间为6 h、12 h、24 h、48 h的细胞及对照组(不加入Vismodegib的完全培养基培养后的细胞)中的总RNA。加药后提取培养48 h的5、10、15、20、25 μM浓度下细胞及对照组(不加入Vismodegib的完全培养基培养后的细胞)中的总RNA。

将已提取的总RNA反转录为cDNA。反转录反应使用takara公司的PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect realtime)试剂盒。

Real-time PCR反应实验：使用takara公司的TBGreenPremixExTaq PremixExTaq TM II试剂盒，按说明书操作，cDNA模板为上述反转录所得产物，以GAPDH作为内参照，对VEGF、Gli1、wnt、TGF-β进行定量分析。

1.5数据分析 收集实验结果采用Graphpad Prism软件进行t-student检验,组间差异进行oneway-ANOVA方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1观察Vismodegib处理恶性胸膜间皮瘤细胞MSTO-211H形态改变 倒置显微镜下，MSTO-211H细胞弥漫分布，呈梭形或短梭形，培养数小时开始贴壁，交织成束，肿瘤细胞丰富密集。经25 μmol/L浓度Vismodegib作用48 h后，显微镜下发现细胞形态改变，细胞间隙变大，细胞突起相对增多，见图1。

图1 倒置相差显微镜下恶性胸膜间皮瘤细胞MSTO-211H形态

2.2Vismodegib抑制MSTO-211H细胞的增殖 Vismodegib是Hedgehog信号通路的抑制剂。本研究采用Vismodegib处理恶性胸膜间皮瘤细胞，以检测Hedgehog信号通路在维持恶性胸膜间皮瘤细胞增殖能力中的作用。CCK-8检测表明Vismodegib从5 μmol/L 浓度开始对MSTO-211H细胞的增殖产生抑制作用，经浓度为5、10、15、20、25、30 μmol/L的Vismodegib处理48 h后，细胞的增殖抑制率分别为10.31 %、25.59 %、34.53 %、43.13 %、60.69 %、88.24 %。计算IC50浓度为20.38 μmol/L(见图2)。

图2 Vismodegib对MSTO-211H细胞增殖的抑制作用

2.3Vismodegib抑制恶性胸膜间皮瘤细胞对Gli1、VEGF、Wnt、TGF-βmRNA的表达 经20.38 μmol/L浓度Vismodegib处理MSTO-211H细胞后，提取即刻、6、12、24、48 h的mRNA，观察到随着时间的增加，Gli1、VEGF、TGF-β、Wnt的mRNA的表达水平均逐次下降。不同时间分子表达抑制结果比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。48 h作用最显著(见图3)。

图3 用20.38 μmol/L浓度Vismodegib处理MSTO-211H细胞

不同时间观察Gli1、VEGF、Wnt、TGF-β mRNA表达改变(与空白对照组比较，*为P<0.05,**为P<0.01)

另外经0、5、10、15、20、25 μmol/L Vismodegib处理48 h后观察到VEGF、Gli1、TGF-β、Wnt的mRNA的表达水平下降，且不同浓度的药物对其分子表达抑制结果的差异具有统计学意义(P<0.05)。其中25 μmol/L Vismodegib作用最显著(见图4)。

图4 不同浓度Vismodegib对MSTO-211H细胞Gli1、VEGF、Wnt、TGF-β mRNA 表达影响

3 讨论

恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一种恶性程度高的肿瘤，发现时常为晚期，而且发病率呈逐年上升趋势。尽管近年对MPM发病机制研究获得一定成果，但仍未提高早期诊断率和患者预后。因此，对MPM发病分子机制的深入研究及研发早期诊断方法和治疗药物十分重要。Hedgehog信号通路被证明在很多癌症中存在高表达及激活，并且与肿瘤的发生及发展相关，如肺癌、皮肤癌、肝癌、胃肠道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌等[11-13]。Hedgehog信号转导的异常激活引起相关通路下游致瘤因子的表达，从而促进侵袭性和转移性癌症的发展[12]。作为下游靶基因转录的直接启动子，Gli家族的表达水平反应Hedgehog信号通路的功能状态。Gli1被活化后进入细胞核内，引起下游VEGF、TGF-β1和Wnt基因的激活，促进肿瘤血管生成、肿瘤细胞侵袭转移[13-16]。近年研究证明Gli1在恶性间皮瘤组织和细胞中有异常高表达[17]。因此，探索Hh通路在MPM中的作用并抑制其异常激活具有广阔研究前景，为治疗恶性胸膜间皮瘤，提供新靶点或途径。

体外培养恶性胸膜间皮瘤MSTO-211H细胞，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。Vismodegib未处理的恶性胸膜间皮瘤细胞呈梭形或短梭形，细胞密集，重叠生长(见图1.A)；经Vismodegib作用后的恶性胸膜间皮瘤细胞间隙变大，突起增多(见图1.B)。使用不同浓度的vismodegib作用于恶性胸膜间皮瘤细胞，培养48 h后，用CCK-8试剂检测细胞生长抑制率，结果见图2。随着vismodegib浓度的增加，对恶性胸膜间皮瘤细胞生长抑制率增加，IC50浓度为20.38 μmoL/L，抑制作用呈剂量-效应关系。20.38 μmoL/L浓度Vismodegib处理MSTO-211细胞，48 h细胞内Gli1 mRNA表达降低明显，提示Hh信号通路被抑制。研究提示Hh信号通路有助于细胞生长，调节细胞增殖，Hh信号通路的激活可能是维持恶性胸膜间皮瘤细胞生长所需的条件。

肿瘤细胞的增殖需有氧和养分，肿瘤血管新生是重要因素。促进肿瘤血管新生的重要因子是VEGF和VEGF受体。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用[18-20]。VEGF在细胞、组织的表达程度正相关于肿瘤微血管的密度。研究发现VEGF的表达水平与肿瘤患者预后相关，患者血液检测其高表达，一般预后较差[21]。研究发现，在MPM组织中VEGF呈高表达，并且与MPM生存之间存在明显正相关性[22]。Ma等[23]的实验表明抑制卵巢癌细胞中Hh/Gli信号通路可降低细胞中Gli1及VEGF表达，并且对卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移产生抑制作用。基底细胞癌和鼻咽癌的相关研究同样证明VEGF和Hh交汇于Gli1，抑制Hh通路激活，VEGF表达降低[24-25]。本实验观察分析不同浓度Vismodegib和同一浓度Vismodegib不同时间处理MSTO-211细胞后，检测VEGF mRNA表达改变，结果提示VEGF表达水平随时间和浓度逐渐降低(见图3和图4)，提示Hh通路抑制剂可通过抑制Gli1，抑制其转录功能，导致其下游靶基因VEGF表达降低。这一结果与文献报道相同。

本实验观察分析不同浓度Vismodegib和半数抑制率浓度Vismodegib不同时间处理MSTO-211细胞后，检测Wnt和TGF-β mRNA表达情况，结果显示Wnt和TGF-β表达水平逐渐降低(见图3和图4)，提示Hedgehog信号通路可能通过Gli1对VEGF、转化生长因子β(TGF-β)和Wnt的表达水平进行调节，以此调控细胞增殖、促进肿瘤血管形成，在MPM的发生发展过程中起关键作用。本实验使用Hedgehog信号通路抑制剂Vismodegib作用于恶性胸膜间皮瘤细胞后，细胞增殖受到抑制，且Gli1、VEGF、Wnt、TGF-β表达均降低，可能为将来诊断和治疗恶性胸膜间皮瘤提供新的靶点或治疗途径。

体内、体外肿瘤细胞所处环境不同可能对细胞信号激活的实验结果有所影响，而且本实验仅针对MSTO-211H细胞。在恶性胸膜间皮瘤早期诊断困难，手术和化疗等单一治疗方式疗效差的情况下，阐明Hedgehog-Gli信号通路在恶性胸膜间皮瘤的发生、侵袭转移中的分子作用机制，以此为靶点研发诊断及治疗方法具有重要意义。本次研究不足之处在于未涉及抑制肿瘤的目的基因、细胞凋亡实验及基因蛋白水平的表达，未完全覆盖恶性胸膜间皮瘤上其他信号通路，抑制剂使用单一等，所得结果可能存在受其他抑瘤因子相互作用影响，需要今后进一步全面证实探究。