不同方法诊断低水平HCV的比较

杨小娇 郁金红

除酶法(EIA)外，抗-HCV的检测一般采用化学发光微粒子免疫分析(CMIA)和电化学发光免疫分析(ECLIA)。但孕妇和肾病或类风湿疾病患者采用这些筛查方法易受到假阳性或假阴性结果的限制，需要进行补充或验证性测试，特别是对于较低HCV流行率的人群。化学发光免疫分析(CLIA)方法检测HCV-cAg能区分现症和过去感染，针对感染6～8周的患者有较高灵敏度。此外，PCR和免疫印迹法(RIBA)的检查是必要的，尤其是当HCV RNA阴性时，可以做RIBA 实验，区分既往感染还是假阳性，有利于流行病学调查。美国CDC建议以适当的信号截止阈值样本/cut-off比率(S/CO)作为抗-HCV确认，以限制需要做补充实验的样本数量，化学发光法推荐为1.0～8.0，ELISA推荐为1.0～3.8[1-3]。本研究重点分析临床检测中不常见的低值，CMIA法检测值在0.40～10.0，比较了不同方法的敏感度，影响因素，排除假阳性和不确定标本，重新设置较准确的截断值，同时分析HCV-Ag和HCV RNA关系。

资料与方法

一、研究对象

2015年9月至2016年12月南京市第二医院就诊的门诊HCV感染患者。CMIA检测31例(S/CO ratio 0.40～10.0 )，33例(S/CO ratio>10.0)和20例(S/CO ratio<0.4)，所有样本血清储存在-20 ℃。

二、试剂

HCV抗体和抗原定量测定试剂盒由雅培贸易(上海)有限公司提供。HCV抗体定性测定试剂盒由北京万泰生物药业股份有限公司提供，HCV RNA定量试剂盒由凯杰生物工程(深圳)有限公司提供，HCV RNA>500拷贝/mL为阳性。RIBA 实验3.0 条状免疫印迹分析，美国全球奇隆公司提供试剂盒。其余检查项目外送。同时检测质控品。

三、方法

采用ELISA、CMIA、ECLIA检测抗-HCV，荧光定量RT-PCR法检测HCV RNA，RIBA法做HCV确认实验，CMIA法检测HCV-Ag。

四、统计方法

应用SPSS 17.0软件绘制受试者工作特征曲线并计算抗-HCV和HCV-Ag阈值。用线性回归计算相关性。

结 果

一、比较不同方法检测低值HCV标本

如表1所示，用CMIA法测31份低值抗-HCV(S/CO 0.40～10.0)标本中，用RIBA测定25.81%有反应，29.03%无反应，45.16%不确定。排除不确定结果的样本，CMIA 和ECLIA两者比较中有52.94%检查不一致，CMIA法假阳性率约为29.41%，假阴性率为5.88%，这31份低值标本病毒定量均是阴性。在不确定的标本中有1份RF值、IgG升高，1份IgA升高。

表1 CMIA法测抗-HCV(S/CO值在0.40～10.0)时不同方法检测HCV结果

续表1

二、ROC曲线分析ECLIA、CMIA、HCV-Ag 和HCV RNA诊断HCV效能

如表 2, 表3和图1，除去RIBA检测结果为不确定标本和血不够没测标本，S/CO值为0.40～10.0有13份，0.00～0.30有19份，11.0～19.0有32份，总共64份样本制作ROC曲线。ECLIA曲线下面积为1.000(95%CI：0.000～1.000)、CMIA 0.997(95%CI：0.000～1.000)、HCV-Ag曲线下面积为0.753(95%CI：0.636～0.870)和HCV RNA曲线下面积为0.679(95%CI：0.551～0.808)。

表2 CMIA法测抗-HCVS/CO 值在0.00～0.30时不同方法检测HCV结果

表3 CMIA法测抗-HCVS/CO 值在11.0～19.0时不同方法检测HCV结果

图1 ECLIA(HCV Ab)、CMIA(HCV Ab)、HCV-Ag和HCV-RNA的ROC曲线

当敏感度和特异度达最大时：ECLIA、CMIA、HCV-Ag 和HCV RNA阈值分别是 15.85 COI, 3.31 S/CO, 3.32 fmol/L和3.94E+03拷贝/mL。

三、HCV RNA和HCV Ag的相关性

64例样本中, HCV RNA阴性的样本没有HCV-Ag的反应。16例HCV-Ag>3 fmol/L，HCV RNA为3.10E+04～1.80E+08 IU/mL。5例HCV-Ag阳性、HCV RNA阴性，回归分析HCV RNA和HCV Ag的相关性R2 为0.91 (斜率=0.6855, 截距=1.6199)差异有统计学意义 (P<0.01)。

四、RIBA结果

RIBA方法检测84份样本，28份(33.3%)为阴性，40份(47.6%)为阳性，16份(19%)为不确定。40份RIBA阳性的结果中，97.5%显示 core 和NS3抗原阳性，37.5%显示NS4-1和NS5抗原阳性，只有2.5%显示 NS4-2阳性。16份不确定标本中分别与Core (43.8%) 和NS3 (56.2%)反应。NS4 和NS5均没有反应。

讨 论

2013年美国不再推荐RIBA方法。但是类似的确认实验INNO-LIA方法在欧洲应用，对于没有开展HCV RNA检测的单位，可以参考RIBA的结果[4]。流行病学调查需要对于抗HCV阳性、HCV RNA阴性的患者，通过RIBA实验区分是既往感染还是假阳性，其中低值抗-HCV样本最难区分。有报道477份抗体阳性的标本，RIBA实验68%真阳性，22%假阳性，10%不确定[5]。这些假阳性结果可能与RF有关，RF可能与免疫球蛋白、肾病综合征、肝病和其他病毒或寄生虫感染存在交叉反应。本研究中，抗HCV低值时，有约四分之一是既往感染，有一半是不确定的。除去不确定的样本，有约近三分之一是假阳性，不确定样本中有2个样品可能受到RF或IgG或IgA的影响。CMIA 和ECLIA两者比较中有52.94%不一致。虽然生物素酶联免疫吸附法第三代比第四代具有更高的特异性，CMIA与ELISA结果也有33.3%不一致。ELISA法抗HCV假阳性率为39.42%， S/CO> 3.8时阳性率为98.5%，1 < S/CO < 3.8时阳性率仅为30%，有报道为26%[6]。

在39个阳性样品测试通过RIBA，HCV-Ag值较低的样本，用ECLIA法时有较高的抗-HCV值。其中一个原因可能与ECLIA的检测范围更广有关，另一个原因可能是患者在HCV感染急性期，HCV-Ag较高，抗-HCV较低；当处于恢复期或慢性期时，抗-HCV呈下降趋势，而HCV Ab呈稳定上升趋势。雅培HCVAg和罗氏HCV RNA两种方法具有较高的相关性，这一结果与其他报告相似[7, 8]。CMIA法较ELISA法更灵敏，HCV基因分型不影响抗原和病毒载量的正相关。

根据ROC曲线，ECLIA和CMIA的准确率较高，HCV RNA的准确率最低。主要原因是HCV RNA是病毒复制的指标，不能反映既往感染情况。HCV-Ag的cut-off值与说明书推荐的基本一致， ECLIA(15.85 COI)、CMIA(3.31 S/CO)和HCV RNA(3.94E+03拷贝/mL)的值均高于本实验室参考值，推荐这些值作为实验室参考，可以带来较高的诊断准确性和特异性。否则，阈值设置为S/CO比值≥1，快速筛查ECLIA或CMIA抗HCV试验可能产生较多的假阳性结果。有报道建议ECLIA法截断值为12.27[9]。为了确认HCV暴露，另一项研究报告称，S/CO比值在3.0到19.9之间的样本应进行RIBA随访，除非进行PCR检测结果为阳性[10]。S/CO比值设置成10.3是提高HCV感染诊断准确性的阈值[11]。

在RIBA检测中，硝基膜上的包装抗原来自HCV合成抗原(Core, NS4-1, NS4-2, NS5)和大肠杆菌表达重组蛋白抗原NS3。对于RIBA不确定的样本，抗-Core反应活性主要与在感染恢复后抗HCV浓度逐渐下降有关，其目的是检测特定的细胞免疫记忆对HCV的反应，作为之前与病毒接触的反应。另一个可能的原因是Core和NS3表现出优先的抗原表达，而NS4和NS5表现较低是非优势抗原。化学发光微粒子免疫测定通过检测HCV基因组中候选结构蛋白抗体C(核心区第1至150个氨基酸)和非结构蛋白抗体(NS3、NS4)。该方法覆盖了整个HCV基因组，对于定性检测HCV是有效的，敏感性有显著提高。Cobas是通过利用核心NS3和NS4蛋白肽的表达及重组抗原检测抗HCV，而ELISA板上覆盖重组HCV基因的结构和非结构段。可见，虽然选择的大多数试剂都含有NS3区和核心区，但在包被或合成抗原的过程、抗原纯度和载体的选择仍有许多差异。

综上所述，通过对几种HCV诊断方法的综合分析，低水平的抗HCV更需谨慎分析。假阳性、假阴性结果会给临床和患者错误的提示，耽误治疗。因此不能盲目相信仪器的结果，对有疑问的应结合病史和临床其他检查来判断，必要时重新复查，然后做确认实验或核酸检测。