6种烟熏液的品质及其多环芳烃的毒性比较

王飞，乔明武,2，黄现青,2,3*，宋莲军,2，薛桂中，孟少华，赵建生，马相杰

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州 450002）（2.河南省食品加工与流通安全控制工程技术研究中心，河南郑州 450002）（3.河南省肉品技术创新中心，河南漯河 462000）（4.河南双汇投资发展股份有限公司，河南漯河 462000）

烟熏液是生物质进行热解产生的可凝性气体经冷凝而得到的一种棕红色至棕褐色的混合物，里面成分复杂，主要为酚类、有机酸类、醛类、酮类、酯类、醇类等[1,2]。近年来，食品安全问题受到人们的广泛关注，传统烟熏食品在熏制过程中会受到致癌物（如多环芳烃）的污染，而烟熏液的使用正好可以弥补这一缺点。烟熏液制备过程中除去大部分的有害物质，且能赋予食品良好的烟熏风味和色泽，并且烟熏液的使用方法简便，可以实现工厂连续化生产。烟熏液可以用于熏肉、熏鱼、熏鸡中，其中有机成分的种类和含量直接影响其质量，例如酚类是烟熏液中主要的抑菌成分，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈维氏弧菌和副溶血性弧菌起抑制作用[3]，且还是主要的烟熏风味物质[4]；烟熏液中羰基化合物可以与食品基质中的氨基化合物发生美拉德反应，生成诱人的褐色物质，并且形成一层坚硬表皮，防止水分散失和细菌的侵入[5]。有机酸是烟熏液中次要的抑菌成分，普遍具有刺激性气味，作用是加速肉类腌制和熏制过程，还可以与食品基质相结合从而具有酸辣的风味[6]。除此之外，烟熏液中还有一定量的有害物质，如多环芳烃。多环芳烃（PAHs）是一类由两个或两个以上的稠合芳香族组成的化合物，是有机物不完全燃烧或高温热解形成的环状化合物，具有致癌和致突变性，是评价烟熏液安全的重要指标[7]。

目前，国外烟熏液应用广泛，但在国内还处于推广应用阶段，品种较单一，对烟熏液的研究主要集中在抑菌防腐，测定其挥发性风味物质等方面[8,9]，而对烟熏液中多环芳烃的测定及毒性风险的定量评价几乎没有。为此，本文选用6种生物质原料制备新型烟熏液，以国外某品牌市售烟熏液为对照，对6种自制烟熏液的品质进行研究分析，以期为优质新型烟熏液的原料筛选奠定基础和为烟熏液的安全使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒜杆、紫苏、陈皮、梨木、桃木、枣木烟熏液，实验室自制；市售烟熏液，漯河双汇提供。

2,6-二氯醌-4-氯亚胺，上海麦克林生化科技有限公司；硅藻土，上海麦克林生化科技有限公司；乙腈，天津市四友精细化学品有限公司；无水硫酸镁，上海麦克林生化科技有限公司；N-丙基乙二胺(PSA)，上海安谱实验科技股份有限公司；封尾C18固相萃取填料，上海安谱实验科技股份有限公司；0.22 μm有机相型微孔滤膜，天津市津腾实验设备有限公司；乙腈中16种多环芳烃混标液，坛墨质检标准物质中心。

1.2 仪器与设备

FA/JA*B型电子分析天平，上海精科天美科学仪器有限公司；PHS-3C型pH计，上海浦春计量仪器有限公司；QP2010气质联用仪，日本岛津公司；CR-5型色彩色差计，日本柯尼卡美能达控股公司；UV-2100型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；WYA-2S数字阿贝折射仪，上海申光仪器仪表有限公司；KDM型控温电热套，山东华鲁仪器公司；LHD型热电偶温度计，江苏九州电热公司；DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机；浙江温岭市林大机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 烟熏液的制备工艺

参考谷风林等[10]的方法，具体工艺如下：

操作要点：

（1）原料前处理：选取无霉变、无灰尘及其它杂质的原料，用摇摆式高速中药粉碎机进行粉碎处理，称取500 g（精确至0.1 g）左右的原料放在不锈钢托盘中，置于105 ℃的鼓风干燥箱干燥5 h后取出，放入干燥器中冷却0.5 h后称量。然后放入鼓风干燥箱中继续干燥1 h，取出后放入干燥器中冷却0.5 h后再次称量。重复以上操作至前后两次质量差不超过1 g，即为恒重。

（2）热解：将烘干后的原料过20目筛，然后称取筛分好的原料60 g置于500 mL二口烧瓶中，斜口上插上热电偶温度计进行温度监测，连接好冷凝及收集装置，打开冷却水开关，打开电热套的电源开关进行热解，电热套采用控温模式，控温电压220 V，无冷凝液滴下时即为热解终点。

（3）冷凝：生物质原料裂解产生的烟雾经过冷凝管，可凝烟雾被冷凝收集，即为粗制烟熏液；不可凝烟雾排出装置。

（4）低温静置：热解完成后将粗制烟熏液放置于-4 ℃冰箱中静置24 h，使木焦油等杂质与烟熏液分离，同时放入冰箱防止烟熏液中水分挥发。

（5）过滤：用双层滤纸过滤，然后进行指标测定。

1.3.2 烟熏液pH值的测定

烟熏液的pH值采用PHS-3C酸度计测定。

1.3.3 烟熏液密度的测定

参照GB 5009.2-2016《食品相对密度的测定》[11]，测定采用比重瓶法。

1.3.4 烟熏液可溶性固形物含量的测定

参考NY/T 2637-2014的方法[12]。用蒸馏水对阿贝折射仪进行校准，然后滴加3滴烟熏液样品到棱镜表面，使其均匀覆盖，对准光源后调节旋钮使视野分成明暗两部分，然后记录读数。市售烟熏液则需要稀释，按下式进行计算。

式中：

P——样品稀释液的可溶性固形物含量，%；

m0——样品质量，g；

m1——样品中加入蒸馏水的质量，g。

1.3.5 烟熏液色差的测定

参照郭文等[13]的方法，将色差计放置于洁净干燥的桌面上，按要求对仪器进行校准。将样品混合均匀后注入石英比色皿中，然后置于检测池中进行测试，通过仪器读取L*值、a*值、b*值。

1.3.6 烟熏液中总酚和羰基化合物含量的测定

参照GB 1886.127-2016《食品添加剂 山楂核烟熏香味料Ⅰ号、Ⅱ号》[14]，用修正吉布斯法测总酚含量，盐酸羟胺法测羰基化合物含量。

1.3.7 总酸含量的测定

参考张珊珊等[15]的方法，采用NaOH滴定法测定总酸含量，并折合成醋酸的质量分数。取0.5 g的样品液，加蒸馏水100 mL，使稀释液呈无色或近无色，加酚酞指示剂3滴，用0.01 mol/L NaOH溶液滴定样品中的酸性成分，滴定至淡红色，30 s内不褪色即为滴定终点，记录NaOH溶液的体积数，并进行空白实验。

式中：

c——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；

V——样品滴定消耗NaOH溶液的体积，mL；

V0——空白滴定消耗的NaOH溶液的体积，mL；

0.060——醋酸的换算系数；

m——试样的质量，g。

1.3.8 烟熏液中多环芳烃的检测

参考GB 5009.265-2016《食品中多环芳烃的测定》[16]，并稍作修改。烟熏液中16种多环芳烃的测定是通过待测物质标准曲线的绘制，进行定性和定量的。具体方法步骤如下：

称取2.00 g样品于离心管A中，加入10.0 mL正己烷涡旋混合30 s后，40 ℃水浴超声40 min，吸取上清液于离心管B中。下层复提一次，合并两次上清液，然后氮吹除去溶剂，吹至近干。

在离心管B中加入4.0 mL乙腈复溶，再加入0.900 g硫酸镁、0.100 g PSA和0.100 g C18填料，涡旋混合30 s后以4500 r/min离心3 min，下层用2.0 mL乙腈复提一次，合并提取液于离心管C中，氮吹溶剂至近干，用乙腈定容至1.0 mL，混匀后过0.22 μm微孔滤膜，制得待测液。

色谱柱为SH-Rxi-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm，日本岛津公司）；柱温度程序：初始温度90 ℃，以20 ℃/min升温至220 ℃，再以5 ℃/min升温至320 ℃，保持2 min；进样口温度250 ℃；不分流进样，进样量为1.0 μL，2.0 min后开阀；载气：高纯氦，柱流量1.0 mL/min；测定方式为选择离子监测方式；色谱-质谱接口温度为280 ℃；离子源温度230 ℃；EI源，电离能量70 eV；质量扫描范围50～450 u，溶剂延迟3 min。

1.4 数据统计

使用SPSS 24对数据进行显著性和相关性统计分析，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 烟熏液基本理化性质的差异分析

表2 烟熏液化学指标的测定Table 2 Determination of chemical indexes of liquid smoke

2.1.1 烟熏液物理指标间的差异分析

在本研究中，6种自制烟熏液的密度为1.02～1.04 g/mL，密度最低是蒜杆烟熏液，最高是梨木和枣木烟熏液。其中6种自制烟熏液的密度均显著低于对照组（p＜0.05），且梨木和枣木烟熏液的密度无显著性差异（p＞0.05），这两种烟熏液的密度，显著高于其它4种自制烟熏液（p＜0.05）。以上分析表明，烟熏液的密度在1.0 g/mL左右，与Ketut等[17]的研究结果类似。

明亮度L*值描述烟熏液样品的透光率，即色泽的深浅。L*值越大说明样品的透光率越强，6种自制烟熏液L*值为45.01～67.56，枣木烟熏液L*值最低，陈皮烟熏液L*值最高。其中6种自制烟熏液的L*值显著高于对照（p＜0.05），这说明自制烟熏液透光率高，而市售烟熏液透光率差，与目测一致。a*值反应样品的红绿度，正值表示红色，负值表示绿色，6种自制烟熏液a*值为23.06～29.86，表明烟熏液色泽偏红，蒜杆烟熏液a*值最低，枣木烟熏液a*值最高。其中6种自制烟熏液的a*值显著高于对照（p＜0.05）。b*值反应样品的黄蓝度，正值表示黄色，负值表示蓝色，6种自制烟熏液b*值为86.68～96.16，表明烟熏液色泽偏黄，梨木烟熏液b*值最低，陈皮烟熏液b*值最高。其中6种自制烟熏液的b*值显著高于对照（p＜0.05）。

可溶性固形物是指液体物质中所有化合物的总称，一定程度上反应烟熏液中有机化合物的含量，6种自制烟熏液可溶性固形物含量为8.90%～15.77%，蒜杆和陈皮烟熏液可溶性固形物含量最低，枣木烟熏液可溶性固形物含量最高。其中6种自制烟熏液的可溶性固形物含量显著低于对照（p＜0.05）。

2.1.2 烟熏液化学指标间的差异分析

烟熏液通常是酸性的，pH值范围大致在1.5～5.5之间[18]。6种自制烟熏液除紫苏烟熏液外，其余烟熏液均呈酸性，pH值为2.54～4.76；烟熏液呈酸性主要是由较高含量的乙酸所导致，生物质在开始热分解时，不稳定结构首先分解生成乙酸，随着温度的上升，大分子结构进一步发生裂解和解聚，生成甲酸、乙酸、丙酸等小分子酸性化合物，此外热解生成的酚类化合物也能解离的H+，它们共同作用导致烟熏液pH值进一步降低[19]。紫苏烟熏液呈碱性，pH值为8.65。Vitt等[20]报道了一种市售烟熏液，pH值为7.3～8.1，与紫苏烟熏液均呈碱性。紫苏烟熏液呈碱性可能是因为紫苏中含有丰富的氨基酸、生物碱等含氮碱性化合物[21]，热解后生成的碱性物质大于酸性物质，从而使溶液显碱性。

酚类化合物是烟熏液中主要的一类抗菌物质，它们能破环细菌的膜系统从而导致细胞质泄露，因此对细菌及一些病原体具有抑制和杀灭作用[22]，并且酚类物质被认为是主要的烟熏风味成分[23]。6种自制烟熏液总酚含量为1.95～8.18 mg/mL，紫苏烟熏液总酚含量最低，枣木烟熏液总酚含量最高。其中6种自制烟熏液中，蒜杆、紫苏和陈皮烟熏液的总酚含量显著低于对照（p＜0.05），梨木、桃木和枣木与对照组无显著性差异（p＞0.05）。蒜杆、紫苏和陈皮烟熏液的总酚含量无显著性差异（p＞0.05），梨木、桃木和枣木烟熏液的总酚含量无显著性差异（p＞0.05），且两类生物质原料总酚含量相差较大，原因可能是梨木、桃木、枣木是天然硬木，其木质素含量远高于蒜杆、紫苏、陈皮等草本科植物，而木质素是由愈创木基、紫丁香基、对羟苯基三个基本单元构成，通过C-C键和C-O键连接而成的立体结构，热解中化学键断裂生成小分子化合物，进而生成愈创木基酚、紫丁香基酚、对羟苯基酚等酚类化合物，从而导致烟熏液中酚类含量偏高[24,25]。

羰基化合物是烟熏液品质的重要指标，包括醛类化合物、酮类化合物和羧酸类化合物，被认为是烟熏液的呈色物质[26]，并且羰基化合物可以与食品基质中的氨基发生美拉德反应，生成褐色物质，羰基化合物含量不同会导致烟熏食品颜色存在差异[27]。6种自制烟熏液羰基化合物含量为2.23～19.81 g/100 mL，蒜杆烟熏液羰基化合物含量最低，桃木烟熏液羰基化合物含量最高。其中紫苏烟熏液中羰基化合物未检出，其余5种自制烟熏液的羰基化合物含量显著低于对照（p＜0.05）。

烟熏液中酸性物质主要是小分子量的酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，它们均具有强烈的刺激性气味，是一类重要的风味物质[28]。6种自制烟熏液总酸含量为1.53%～12.51%，蒜杆烟熏液总酸含量最低，桃木烟熏液总酸最高。其中紫苏烟熏液中总酸未检出，其余5种自制烟熏液中蒜杆和陈皮的总酸含量显著低于对照（p＜0.05），梨木、桃木和枣木烟熏液的总酸含量与对照组相比无显著性差异（p＞0.05）。

2.2 烟熏液品质指标的相关性分析

本研究采用Pearson相关系数分析烟熏液9个品质指标之间相关性，相关系数越大，说明指标间的相关性越强，相关系数大于0.9，说明其相关性较好，结果见表3。

表3 烟熏液品质指标间的相关性分析Table 3 Correlation analysis of quality indexes in liquid smoke

烟熏液密度与主要品质成分可溶性固形物、总酚、羰基化合物、总酸均呈正相关，其中与可溶性固形物含量的相关性最强，相关系数为0.998，这是因为可溶性固形物是指烟熏液中所有化合物的总称，包括酚类、羰基化合物和酸类，而化合物的总量直接影响密度的大小。

烟熏液的色差值与主要品质成分可溶性固形物、总酚、羰基化合物、总酸存在一定的联系。色泽L*值与可溶性固形物含量相关性最高，相关系数为-0.973，这是由于色泽L*值反应液体的透光率，可溶性固形物含量反应液体中有机物质的含量，其测定原理是折射定律，有机物质含量越多，对光线的折射能力就越强，光线透过介质的能力变弱，从而导致透光率变差。色泽a*值与色泽b*值均与可溶性固形物的相关性最强，相关系数分别为-0.645和-0.986，且烟熏液的a*值与b*值均为正值，这表明烟熏液中的可溶性固形物以红色和黄色为主。

烟熏液的pH值与主要品质成分总酚、羰基化合物、总酸均呈极显著负相关（p＜0.01），与可溶性固形物含量无显著相关性（p＞0.05）。其中pH值与总酸的相关性最强，相关系数为-0.939，这是因为pH值反应烟熏液中H+的浓度，pH值越低则H+浓度越高，而解离出的H+主要由酸性物质提供，导致pH值与总酸呈完全相反的趋势。

2.3 烟熏液中PAHs含量的差异分析

由表4可知，7种烟熏液中16种多环芳烃均被检测到。不同烟熏液中的PAHs差别较大，含量范围为0.10～1586.45 µg/kg。其中PAHs的代表物苯并[a]芘的含量范围是0.13～1.53 µg/kg，梨木和桃木烟熏液中的苯并[a]芘含量显著高于对照组（p＜0.05），陈皮和枣木烟熏液中的苯并[a]芘含量显著低于对照组（p＜0.05），蒜杆和紫苏烟熏液中的苯并[a]芘含量与对照组相比无显著性差异（p＞0.05）。PAH4包括苯并[a]蒽、䓛、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘，它们具有较强的致癌毒性，因此欧盟对PAH4总量的限量标准为12 µg/kg[29]。紫苏和陈皮烟熏液的PAH4含量显著高于其它5种烟熏液（p＜0.05），且蒜杆、梨木、桃木、枣木、市售烟熏液的PAH4含量无显著性差异（p＞0.05）。美国环境保护署（EPA）将16种PAHs列为优先控制污染物[30]。PAH16含量范围是123.53～2222.31 µg/kg，陈皮烟熏液的PAH16含量显著高于市售烟熏液（p＜0.05），其余5种自制烟熏液显著低于市售烟熏液（p＜0.05）。

表4 烟熏液中多环芳烃的含量Table 4 Concentrations of PAHs in liquid smoke

烟熏液中16种多环芳烃含量普遍较高的是苊烯。蒜杆、紫苏、陈皮、桃木、枣木烟熏液中含量最高的多环芳烃均是苊烯，并且蒜杆、紫苏、桃木、枣木烟熏液中的苊烯含量显著低于陈皮烟熏液中苊烯含量。梨木烟熏液中含量最高的多环芳烃是苊，其次是苊烯；市售烟熏液中含量最高的是芴，其次是苊烯。Enayat等[31]对3家企业的11种商用烟熏液的多环芳烃进行测定，其中9种烟熏液中苊烯含量最高，这与本实验结果一致。

2.4 烟熏液中PAHs的组成特征

PAHs根据其分子量可分为轻环（2～3环）、中环（4环）和重环（5～6环），通过分析PAHs的组成特征可以反应不同烟熏液的差异性和相似性[32]。图2为7种烟熏液中不同环数PAHs含量占总含量的百分比。烟熏液中3环的多环芳烃分别占总多环芳烃的94.23%（蒜杆）、94.09%（紫苏）、95.67%（陈皮）、60.05%（梨木）、89.05%（桃木）、90.78%（枣木）、97.39%（市售），这表明七种生物质在热解过程中，烟熏液的多环芳烃主要以3环为主。梨木烟熏液中2环（29.34%）、5环（5.74%）、6环（4.07%）的占比远高于其余6种烟熏液。

7种烟熏液中2环的PAHs占比范围是0.52%～29.34%；3环的PAHs占比范围是60.05%～97.39%；4环的PAHs占比范围是0.36%～3.69%；5环的PAHs占比范围是0.08%～5.74%；6环的PAHs占比范围是0.05%～4.07%；它们之间的占比相差较大，原因可能是不同的生物质具有不同的结构，它们是由纤维素、半纤维素和木质素组成的高分子结构，在高温热解的条件下会发生化学键的断裂和重新聚合，在这个过程中也会产生多环芳烃及其它化合物，原料和热解方式的不同会影响烟熏液中多环芳烃的含量和组成。

2.5 烟熏液中PAHs的毒性风险评估

综上分析烟熏液的基本组分及多环芳烃的分布。这些丰富的功效成分赋予烟熏食品良好的风味及品质，但也存在一些有害物质，例如致癌物PAHs带来的风险不容忽视，因此对烟熏液的毒性风险评估至关重要。

BaP致癌性强、性质稳定、检测灵敏度高，与其它PAHs具有较强相关性等特点，因此采用BaP作为毒性当量（toxic equivalent quantity，TEQ）来评价烟熏液中PAHs的毒性风险。Nisbet等[33]通过毒理学实验测定不同PAHs相对于BaP的毒性当量因子（toxic equivalent factors，TEFs），提出以毒性最强的BaP为参考，设其TEF值为1，其它15种多环芳烃折算成相对应的毒性效应，具体数值见表5。烟熏液中单个多环芳烃与其对应的TEF相乘后累加，即为毒性当量浓度TEQBaP，具体公式如下：

式中：

Ci——第i个PAHs的实际浓度，单位μg/kg；

TEFi——第i个PAHs的毒性当量因子；

TEQBaP——基于BaP的当量浓度，单位μg/kg。

由表5可知，六种自制烟熏液TEQBaP分别为：蒜杆1.74 μg/kg、紫苏2.25 μg/kg、陈皮4.25 μg/kg、梨木5.00 μg/kg、桃木1.37 μg/kg、枣木0.64 μg/kg；市售烟熏液为3.18 μg/kg。截至目前，没有关于烟熏液中多环芳烃的限量标准。烟熏液通常作为烟熏风味增强剂添加到肉中，添加方式根据产品的类型分为浸渍、注射、涂抹等，赋予产品烟熏风味，从而替代传统烟熏。而GB 2762-2017《食品中污染物限量》关于熏、烧、烤肉类中BaP的限量标准为5 μg/kg，因此，烟熏液中多环芳烃的带入以及热加工过程中产生的多环芳烃之和应低于该标准。六种自制烟熏液和市售烟熏液相比，梨木烟熏液的毒性风险最高，枣木烟熏液的毒性风险最低，因此，可以选择合适的原料制备安全的烟熏液。

表5 烟熏液中PAHs的毒性当量Table 5 Toxic equivalents of PAHs at different liquid smoke

3 结论

3.1 本实验选取6种生物质原料，利用自制生物质热解反应器制备烟熏液，测定其基本理化指标和16种多环芳烃的含量、分布及毒性风险评估，并与市售烟熏液作对比。烟熏液表观及挥发性成分存在显著性差异。烟熏液呈棕褐色，蒜杆烟熏液的L*值最大，说明其最明亮，透光率较高；烟熏液的a*值和b*值均为正值，说明烟熏液色泽偏向红色和黄色；烟熏液通常呈酸性，仅紫苏烟熏液呈弱碱性，pH值为8.65。三种果木烟熏液的可溶性固形物、总酚、羰基化合物、总酸显著高于蒜杆、紫苏、陈皮烟熏液，这主要是由于热解原料不同所导致的。

3.2 烟熏液的品质指标存在一定的相关性。其中密度与色泽L*值、色泽b*值、可溶性固形物含量、羰基化合物；色泽L*值与色泽b*值、可溶性固形物含量、羰基化合物；色泽b*值与可溶性固形物含量；可溶性固形物含量与羰基化合物；pH值与总酸含量的相关系数均在0.9以上，这表明烟熏液的化学成分与物理指标联系密切，其中的酚类、羰基化合物、总酸含量决定烟熏液的品质。

3.3 烟熏液中16种PAHs均被检测到。烟熏液中PAHs以轻环为主，主要是苊烯和苊，且七种烟熏液3环PAHs占比最高。采用BaP的毒性当量因子对7种烟熏液进行毒性风险评估，研究表明，自制和市售烟熏液均具有一定的毒性，毒性大小依次为：梨木＞陈皮＞市售＞紫苏＞蒜杆＞桃木＞枣木。