基于GEO数据库构建精神分裂症miRNA-mRNA调控网络

何 梅，游 旭，杨云斌，李艳萍，张丽芬，卢自祥，张云桥，龙 青，马 晓，曾 勇*

（1.红河州第二人民医院，云南 红河 654300；2.昆明医科大学第六附属医院，云南 玉溪 653100

精神分裂症是一种临床表现复杂、多种因素所致的严重的慢性精神疾病［1］。研究显示，异常的神经传递与精神分裂症的大部分临床症状有关［2］。而小型非编码 RNA（Small non-coding RNA，miRNA）与疾病的病理机制密切相关［3-5］，这种只有20～22个核苷酸的miRNA作为表观遗传之一，不仅在哺乳动物的脑组织内广泛参与基因的表达［6］，而且它作为转录后调控因子积极参与各种疾病的基因表达过程［7-8］。研究表明，miRNA与神经精神疾病（如精神分裂症）具有很强的关联性［9-10］。虽然国内外对精神分裂症的病因研究（如遗传基因多态性、差异基因表达水平、神经影像等）积累了很多研究成果，但是至今精神分裂症的诊断仍然依赖于症状学，有别于其他疾病可以采用病理、检验、影像等辅助手段作出客观的诊断。而在实际临床工作中，医务人员的诊疗水平以及患者症状的时空变化可能会造成对精神分裂症的误诊或漏诊。因此，迫切需要识别出精神分裂症客观的分子诊断标志物以及揭示疾病发病的分子调控机制，为其早期的准确诊断和治疗提供客观依据。当今，生物信息学是利用计算机和专用软件，从整体层面揭示疾病发生机制的研究方法［11］。而GEO数据库是由美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Informa⁃tion，NCBI）建立，可免费提供大量的基因表达数据，例如芯片和高通量测序基因表达数据集。本研究基于GEO数据库中精神分裂症患者和健康对照样本（脑组织和外周血）的比较，整合生物信息学方法筛选出差异表达基因，并构建可能导致精神分裂症发生的miRNA-mRNA调控网络，以期阐明疾病的发生过程，为精神分裂症分子遗传学发病机制的探索提供参考。

1 资料和方法

1.1 资料获取

通过NCBI网站中GEO Datasets进入GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds），检索“miRNA AND schizophrenia”，限制研究种属为Homo sapiens，筛选出GPL16016平台所提供的GSE54578数据集，该数据集的研究对象为15例健康对照组和15例精神分裂症患者的外周血单核细胞；同样，在GEO数据库搜索精神分裂症患者死后大脑组织样本中mRNA的表达数据集，筛选出GPL6244平台所提供的GSE145554数据集，该数据集的研究对象为12例精神分裂症患者和12例健康对照组的死后大脑扣带回锥体神经细胞（浅层皮质和深层皮质）。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血中差异表达miRNA的识别

利用GEO数据库中的GEO2R在线分析工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）识别精神分裂症外周血中差异表达的miRNA，筛选条件限制为P＜0.05和|logFC|＞1，logFC＜0的差异基因为下调的基因，而logFC＞0的差异基因为上调的基因。按照P值以及差异倍数识别miRNA的差异表达情况。

1.2.2 差异表达miRNA下游靶向基因和上游转录因子的预测

FunRich在线软件工具（http：//www.funrich.org/）可以提供如转录因子、生物学过程、细胞组成成分、分子功能和蛋白质互作功能等注释。本研究利用该软件分别获取差异表达miRNA的下游靶向基因和上游转录因子的信息。

1.2.3 大脑组织样本中差异表达mRNA数据处理

利用GEO2R分别对浅层和深层的锥体神经细胞mRNA表达值进行差异表达分析，纳入差异表达mRNA的标准参照提供数据集的原始论文：P＜0.05、logFC＞0为上调的差异基因，logFC＜0为下调的差异基因［12］。

1.2.4 目标mRNA的确定

鉴于miRNA具有抑制或降解其靶向mRNA的生物学功能，将外周血上调的miRNA所预测的靶向基因与大脑样本中下调的基因取交集基因，下调miRNA所预测的靶向基因与大脑样本中上调的基因取交集基因，最终将交集基因确定为目标mRNA。

1.2.5 目标mRNA的GO和KEGG通路富集分析

基因本体论（Gene Ontology，GO）是一种对生物数据信息整合和利用的重要工具，其涵盖3个经典领域：生物过程、细胞成分和分子功能；京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）是研究基因组、生物途径、疾病、化学品和药物的高层次功能数据库；利用Omicshare在线工具（https：//www.omicshare.com/）对目标mRNA进行GO注释和KEGG通路富集分析以揭示目标mRNA所参与的人体生物学功能以及富集的重要通路。

1.2.6 构建PPI网络与miRNA-mRNA调控网络

利用String在线软件（https：//string-db.org/）构建目标mRNA的蛋白质-蛋白质互作网络（Proteinprotein interaction network，PPI）信息，将各蛋白映射至String数据库，在综合得分≥0.15的条件下建立互作网络，具有互作关系的目标mRNA被认为在精神分裂症的发病机制中可能存在更强的关联，最终构建miRNA-mRNA调控网络。

2 结 果

2.1 芯片数据中差异表达miRNA的识别

采用GEO2R在线工具对GSE54578数据集中15例健康对照组和15例精神分裂症患者的外周血单核细胞miRNA表达值进行差异分析，共识别出29个显著差异表达的上调miRNA，其中前10个上调miRNA的差异倍数和P值见表1。

表1 外周血单核细胞中筛选出前10个显著差异表达的上调miRNA

2.2 差异表达miRNA靶向基因和转录因子的预测

采用FunRich在线工具对29个差异表达的miRNA进行差异分析，最终筛选出8个具有靶向基因的miRNA。转录因子是一组能与目标基因5`端上游特定序列专一性结合，保证目标基因能够在特定的时间与空间中表达的蛋白质分子，其通过改变宿主细胞的基因表达可促进疾病的发生。因此，利用FunRich在线工具预测差异表达miRNA的上游转录因子，获取前10个差异显著的转录因子：EGR1、SP1、POU2F1、SP4、NKX6-1、ZFP161、FOXA1、MEF2A、SOX1、HOXA5。见表2。

表2 8个上调的差异表达miRNA所靶向mRNA的数目

2.3 目标mRNA的识别

鉴于miRNA/mRNA呈负反馈调控关系，将8个上调miRNA所靶向的mRNA分别与GSE145554数据集中大脑扣带回浅层皮质和深层皮质锥体神经细胞所筛选的下调mRNA取交集基因。结果显示：大脑扣带回浅层皮质有57个mRNA，深层皮质有190个mRNA，共247个下调的差异表达mRNA；hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-151a-5p和hsa-miR-4429的靶基因与深浅皮层下调mRNA均无交集基因；hsa-miR-182-5p的靶基因与深浅皮层下调mRNA具有6个交集基因（L1CAM、NRN1、AK3、LSM14A、RNF144B、GCNT1），hsa-miR-96-5p的靶基因与下调mRNA具有5个交集基因（AK3、GINM1、TM9SF4、RLIM、GCNT1），hsa-miR-146a-5p的靶基因与下调mRNA具有1个交集基因（KBTBD4），hsa-miR-155-5p的靶基因与下调mRNA具有2个交集基因（LSM14A、KRAS），hsa-miR-15a-5p的靶基因与下调mRNA具有 8个交集基因（PELI2、NRN1、CD28、RNF144B、RASSF5、CCDC85C、ARHGDIA、TBP）。共5个miR⁃NA与17个下调mRNA具有互作关系，这17个mRNA被确定为目标mRNA。见图1。

图1 5个miRNA与17个下调mRNA的互作关系

2.4 目标mRNA的GO和KEGG通路富集分析

GO注释结果显示：生物过程中，靶基因显著富集于内分泌信号通路、X染色体失活调节剂量补偿、前脑星形胶质细胞分化与发育、轴突发生正调控、蛋白质多泛素化以及Toll信号通路的调控等；细胞组成成分中，靶基因显著富集于免疫突触、雄性原核、转录因子TFIIA复合物、雌性原核、转录前启动复合体、信使核糖核蛋白复合物以及轴突生长；分子功能中，靶基因显著富集于三磷酸核苷腺苷酸激酶活性、泛素蛋白连接酶活性、Rho GDP解离抑制剂活性、TFIIB类转录因子结合、泛素蛋白转移酶活性以及轴突导向受体活性。KEGG通路富集分析结果显示：靶基因主要富集于非小细胞肺癌、T细胞受体信号通路、神经营养因子信号通路、细胞衰老、轴突引导、病毒致癌作用、Rap1信号通路、HTLV-I感染以及Ras信号通路等。

2.5 构建蛋白互作网络及miRNA-mRNA调控网络

将目标mRNA导入String数据库，获得17个节点和11个边缘的蛋白互作网络。这11个蛋白均有其靶向的miRNA，hsa-miR-15a-5p可靶向CD28、RNF144B、RASSF5、ARHGDIA、TBP；hsa-miR-96-5p靶向AK3、TM9SF4、RLIM、GCNT1；hsa-miR-155-5p靶向 KRAS；hsa-miR-182-5p靶向 L1CAM、AK3、RNF144B、GCNT1。最终构建精神分裂症miRNA-mRNA调控网络。见图2、图3。

图2 目标mRNA的蛋白互作网络分析图

图3 精神分裂症miRNA-mRNA调控网络

3 讨 论

脑组织和外周血中的miRNA对其靶向基因调控失调可能是精神分裂症的发病机制之一［13-16］。本研究对GEO数据库中的精神分裂症外周血单核细胞miRNA数据集进行差异分析，共识别出29个上调的差异表达miRNA，但最终筛选出8个具有靶向mRNA的miRNA。由于转录因子和miRNA之间可发挥相互的调控作用［17］，并共同对mRNA的转录及翻译产生影响，这种生物过程被认为是细胞代谢的调节剂［18］。本研究利用FunRich在线工具预测出miRNA的前10个显著差异的转录因子，其中EGR1是精神分裂症的易感基因：EGR1表达异常可能与精神分裂症的发病密切相关［19］；EGR1的功能表现为积极参与突触可塑性和突触传递，且EGR1所参与的突触调控网络失衡是导致精神分裂症发生的重要病理基础［20］。因此，推测EGR1作为上游转录因子参与8个miRNA的基因表达可能是精神分裂症的发病原因之一。

8个差异表达miRNA的靶基因与GSE145554数据集所获取的差异表达mRNA取交集基因，共筛选出17个下调的目标mRNA。GO功能注释分析显示：它们积极参与神经系统的生物学功能，如正向调控轴突的发生、前脑星形胶质细胞的分化及发育；KEGG通路富集分析显示：靶向基因积极参与人体的重要信号通路，其中4条信号通路与精神分裂症密切相关，如Ras信号通路、Rap1信号通路、脑源性神经营养因子信号通路以及轴突引导信号通路，与既往研究结果一致［21-24］。这些目标mRNA均具有精神分裂症潜在分子标志物的可能。

PPI网络分析显示：17个目标蛋白只有11个具有互作关系，而在7个目标蛋白构成最大的互作网络中，KRAS原癌基因为核心基因，CD28为免疫相关基因。已有研究显示，KRAS原癌基因与精神分裂症具有相关性，其剪切变体与少突胶质细胞维持轴突的髓鞘功能相关［25］；精神分裂症与健康对照组的样本中参与MAPK通路的KRAS存在差异表达水平，差异有统计学意义［26］。同时，免疫功能与精神分裂症的相关性研究显示：循环细胞因子、氧化应激和炎症因子标志物所致的免疫功能障碍与精神分裂症具有明显关联，而这种免疫障碍可能是精神分裂症从首发精神病演变为慢性病态的主要原因［27］。而本研究所识别的CD28参与的免疫功能也可能诱发精神分裂症［28-30］。因此，本研究连接度最高的2个基因（KRAS与CD28）可以做为精神分裂症的易感基因。而且，miRNA-mRNA调控网络的结果显示，hsa-miR-15a-5p靶向调控 CD28，hsa-miR-155-5p靶向调控 KRAS。KRAS与 ARHGDIA、TM9SF4、TBP、RASSF5、L1CAM、CD28具有蛋白互作关系，CD28与KRAS、TBP、L1CAM具有蛋白互作关系，结果表明，miRNA-mRNA调控网络参与疾病的发生机制是错综复杂的，且不是单一的某个基因就可以决定疾病的病理过程。

本研究利用GEO数据库并整合生物信息学方法构建精神分裂症miRNA-mRNA调控网络的研究方法为探索精神分裂症的发病机制提供了一定参考价值。本研究局限性在于：①GEO数据库中的GSE54578和GSE145554数据集原始样本数量较少；②缺乏在精神分裂症大样本中对miRNA和mRNA实施表达量验证；③缺乏在体外细胞系中验证miRNA-mRNA的互作关系。