特异性高效价腺病毒中和抗体血浆抗体滴度消长性研究

张春敏 党润 杨文敏 陈卓瑶 戎霞 冯立强 刘文宽 杨镒宇 陈飞燕*

儿童重症腺病毒肺炎是儿童重症监护室常见的疾病，部分患儿进展加重可导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS），甚至死亡，这一类疾病可严重威胁儿童生命及健康［1］。然而，目前针对重症腺病毒肺炎尚无有效特异性治疗措施，仅对症支持治疗为主。特异性高效价腺病毒中和抗体血浆（Specific High level Adenovirus Neutralizing Antibodies Plasma，SHL-ANAP）是指从健康献血志愿者的血浆中筛查出腺病毒中和抗体滴度大于1∶1 000 的特异性血浆［2，3］。我们前期研究发现，早期应用筛选出来的高效价腺病毒中和抗体血浆治疗儿童重症腺病毒肺炎取得良好的效果，可减少发热时间及降低死亡率［4］。然而，腺病毒中和抗体相关生物制剂目前尚处在研发阶段，因此，建立特异性高效价腺病毒中和抗体血浆库，将其储备用于治疗重症腺病毒感染具有重大的临床意义。

经过筛查的SHL-ANAP，需要按照现行的血液制品保存方式进行保存储备备用，经过-20℃保存后，其抗体滴度是否发生变化尚不明确。因此，我们检测了筛查出的SHL-ANAP 保存1 年前后的抗体滴度，以明确经筛选出的SHL-ANAP 保存效果，了解其抗体滴度变化，进一步指导优化SHL-ANAP的临床使用。

1 临床材料

1.1 一般资料由广州血液中心输血研究所从健康献血志愿者的血浆中筛查出的SHL-ANAP（3型或7 型，中和抗体滴度＞1∶1 000），以及它们在常规-20℃冷库保存1 年后的样本。该研究经医院伦理委员会批准（穗妇儿 科伦 通字（2020）第56100号），患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法由广州血液中心留存健康献血志愿者的血样运用分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告腺病毒微量中和检测法检测其样本抗体滴度。锁定SHL-ANAP 后发放至广州市妇女儿童医疗中心输血科保存和临床应用。1 年后，将剩余12 份样本再次应用该方法进行抗体滴度检测。

1.3 SHL-ANAP 检测方法SEAP 报告腺病毒微量中和检测法［3］是用无酚红的DMEN 培养基对12份血浆进行梯度稀释，共设置了5 个稀释梯度，分别为1∶18，1∶72，1∶288，1∶1152 和1∶4608，加入等体积的SEAP 报告病毒（4.0×107vp/ml），用SEAP 试剂盒（Phospha-Light System，AB，T1016）进行检测，使用荧光照度计，检测吸光值，根据吸光值变化计算待测血浆的滴度，以抑制了50%的吸光值的血清稀释度作为待测血浆的滴度，并以血清的滴度≥1∶72 视为阳性血清，＜1∶72 视为阴性血清。

1.4 统计方法使用SPSS 25.0 软件分别对ADV3型、ADV7 型冰冻保存前后的血浆腺病毒中和抗体滴度进行配对Wilcoxon 秩和检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

共留存12 份特异性高效价腺病毒中和抗体血浆进行抗体滴度检测，其中8 份ADV3 型高效价腺病毒中和抗体血浆，4 份ADV7 型高效价腺病毒中和抗体血浆。结果显示，冻存前后12 份腺病毒中和抗体血浆抗体滴度具有不同程度地下降，但均大于1∶1000（见表1）。Wilcoxon 配对秩和检验结果显示，ADV3 型、ADV7 型高效价血浆冰冻保存前后血浆抗体滴度均无显著差异（P＞0.05，见表2）。

表1 SHL-ANAP 冻存前后抗体滴度的变化

表2 ADV3、ADV7 冻存前后抗体滴度变化比较（配对Wilcoxon 秩和检验）

3 讨 论

近年来许多研究显示，早期应用康复者血浆治疗重症病毒感染患者取得良好的疗效，例如埃博拉病毒、流感病毒、SARS 冠状病毒等感染者，早期通过输注相应康复者血浆后病情明显好转、病毒载量显著降低［5，6］。然而也有一部分研究表明重症病毒感染者使用相应康复者血浆无法显著降低病死率［7］，这可能与相应康复者血浆中不含有中和抗体或者中和抗体滴度较低有关。我们前期研究采用经筛选的SHL-ANAP 治疗重症腺病毒肺炎患儿亦取得良好的疗效［4］，因我们所应用的SHLANAP 筛查出的抗体滴度均大于1∶1000，且可选择性的输入与患儿腺病毒分型相同的高效价血浆，从而取得较好的治疗效果。此外，我们应用的高效价血浆是由广州血液中心从普通血浆筛选而来，来源可靠且价格便宜，不会增加患儿家庭经济负担。因而，高效筛查SHL-ANAP 并可妥当保存其抗体滴度，对于应用于救治重症腺病毒感染病人有重要意义，并为后续SHL-ANAP 血浆库的建立提供一定的依据。

目前用于检测血清中腺病毒中和抗体的主要方法分为两类：一种采用细胞病变法，孵育腺病毒与抗体后，检测细胞的活性或者观察感染细胞的病变效应；另一种则采用报告基因法，血清中的中和抗体可以有效地抑制病毒感染从而减少报告基因的数量及表达程度，而后可通过检测被抑制程度来确定中和抗体水平，本研究所使用的SEAP 报告腺病毒微量中和检测法属报告基因法。传统的细胞病变法由于检测周期较长（4-8 d），观察相对主观，且灵敏度较低，对于快速准确检测并不适用［8］；而SEAP 报告腺病毒微量中和检测法除了可大大减少检测时间（30 h）外，还具备更为简便快捷的操作方法，并且重复性好。 SEAP 报告腺病毒微量中和检测法可实现快速和大样本的检测，非常适合用于SHL-ANAP 的筛查。

常规操作中，新鲜冰冻血浆可置于温度≤-18℃冷库冰冻保存1 年，而普通血浆则可保存4 年［9］。目前有研究显示，新型冠状病毒感染患者恢复期特异性血浆的抗体滴度在冰冻状态下至少可以维持4 个月不衰减［10］。然而，目前并没有相关研究显示SHL-ANAP 冰冻保存后抗体滴度的变化情况。本研究经筛查后的SHL-ANAP 立即置于-20℃冷库冰冻保存，1 年后ADV3 型、ADV7 型抗体滴度虽然有下降趋势，但与冻存1 年前相比，差异并无显著性意义。而且，冻存1 年后的SHL-ANAP 抗体滴度仍均＞1∶1000，说明目前SHL-ANAP 保存方法能达到保存效果，一年的-20℃冰冻存储不会影响高效价血浆的效价滴度，意味着大批量筛查出高效价血浆后可以-20℃冰冻保存，为腺病毒流行到来时做好战略储备。另外，这一结果也为高效价血浆保存期的界定提供一定的数据支持。

本研究观察发现SHL-ANAP 在-20℃冰冻储存1 年后仍有较高的抗体滴度，可以继续用于重症腺病毒患儿的救治中。另外，SEAP 报告腺病毒微量中和检测法能够用于大规模筛查和评估高效价血浆的中和抗体滴度。但是由于本研究样本量较小且检测方法稀释梯度不足导致部分数据未得到最高值，后期尚需扩大样本量及增加稀释梯度进一步研究。