肝细胞癌组织中ALDH1A1、miR-140-5p表达及其与化疗敏感性的关系

刘晓斌 唐裕福 陈明洋 辛建 张巍

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是生长速度快、发生率较高的肿瘤，有20%～25%的HCC患者可通过手术切除、肝移植进行治疗，但多数患者首次就诊时已丧失手术机会[1-2]。临床多采用肝动脉插管化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)治疗中晚期HCC患者，但部分患者可发生耐药现象，影响TACE治疗效果[3-4]。乙醛脱氢酶1A1(acetaldehyde dehydrogenase 1A1, ALDH1A1)在肝门部胆管癌中呈高表达，具有评估肝门部胆管癌患者预后的价值[5]。微小RNA-140-5p(microRNA-140-5p，miR-140-5p)在HCC中表达水平较低，其经LncRNA AK002107负调控进而影响HCC的上皮-间质转化过程[6]。HCC组织ALDH1A1、miR-140-5p表达水平可能与TACE的化疗敏感性有关。本研究测定ALDH1A1、miR-140-5p在HCC组织中的表达，并分析二者与TACE的化疗敏感性的关系。

资料与方法

一、临床资料

选取2016年4月至2021年1月解放军北部战区总医院行TACE治疗的Ⅲ期HCC患者91例，男63例，女28例，年龄为(50.9±12.0)岁。纳入同期非HCC患者91例，男65例，女26例，年龄为(51.8±12.2)岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。收集HCC患者肿瘤分化程度、肿瘤直径、是否合并肝炎、肿瘤部位及血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)等临床资料。本研究符合《赫尔辛基宣言》，经伦理委员会批准，且受试对象知情同意。

纳入标准：①符合《2010年美国肝病年会(AASLD)肝细胞癌诊疗指南》[7]中HCC诊断标准，经病理检查证实；②肿瘤分期为Ⅲ期；③TACE治疗前未进行靶向治疗、根治性切除术、射频消融治疗等；④检查资料完整。排除标准：①有中重度肝动脉-肝静脉瘘/门静脉瘘者；②有其他恶性肿瘤者；③肺、肾、心功能不全、胃肠道溃疡者；④妊娠期哺乳期女性、有免疫系统疾病者。

二、方法

(一)Ualcan数据库检索 使用Ualcan数据库(http://ualcan.path.uab.edu)检索ALDH1A1表达情况，gene symbol：ALDH1A1，TCGA：Liver hepatocellular carcinoma。

(二)TACE治疗及疗效观察 使用Seldinger法进行TACE治疗，HCC患者术前禁食6 h，取仰卧位，消毒，利多卡因局麻，穿刺股动脉，置入导管鞘，利用平板血管造影机(ALLura Xper FD20，德国飞利浦公司)行DSA造影检查，了解肿瘤血管分布、位置、大小等情况，经导管注入表阿霉素、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C和超液化碘油，拔出导管、加压包扎。

HCC患者TACE治疗前后1个月均行CT检查。两位高年资影像医生使用双盲法对CT图像进行分析，分析肿瘤与周围血管的关系、肿瘤形态大小、强化程度、部位、强化形式。参照文献[8]对TACE疗效进行评价，完全缓解(complete response, CR)：肿瘤完全坏死，无强化区域；部分缓解(partial response, PR)：肿瘤部分坏死，强化区面积减少>50%；疾病稳定(stable disease, SD)：肿瘤反应强度处于PD与PR之间；进展(progressive disease, PD)：为新病灶出现或原有病灶>25%。将TACE疗效属于PD、SD的HCC患者纳入化疗耐药组(53例)，将TACE疗效达到CR、PR的HCC患者纳入化疗敏感组(38例)。

(三)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织ALDH1A1 mRNA、miR-140-5p表达水平 将HCC组和非HCC组活检时留取的组织研碎，用TRIzol试剂盒(沈阳万类生物科技有限公司)抽提总RNA，之后用First Strand cDNA Synthesis Kit(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)制成cDNA。最终，用qRT-PCR仪(ABI公司)及Hieff qPCR SYBR®Green Master Mix(翌圣生物科技有限公司)将cDNA扩增、检测。扩增参数：97℃预变性4 min；96℃变性20 s，63℃退火/延伸15 s，40个循环。ALDH1A1、miR-140-5p分别以GAPDH、U6为内参，引物序列见表1。ALDH1A1 mRNA、miR-140-5p相对表达量以2-ΔΔCT法计算。

(四)生物信息学软件预测ALDH1A1与miR-140-5p的关系 ALDH1A1与miR-140-5p的关系使用生物信息学网站(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)进行检索预测。

三、统计学方法

结 果

一、Ualcan数据库中正常肝组织、HCC组织ALDH1A1 mRNA表达水平比较

Ualcan数据库显示，正常肝组织ALDH1A1 mRNA为(559.76±138.67)，低于HCC组织的(851.70±245.89)，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 ALDH1A1、miR-140-5p、GAPDH、U6引物序列

二、两者ALDH1A1、miR-140-5p表达情况

HCC组ALDH1A1 mRNA表达水平高于非HCC组，miR-140-5p表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 HCC组与非HCC组患者组织ALDH1A1、miR-140-5p表达水平比较(±s)

三、HCC组织中ALDH1A1 mRNA表达水平与miR-140-5p的相关性

Pearson法分析显示，HCC组织中ALDH1A1 mRNA水平与miR-140-5p呈负相关(r=-0.583，P<0.05)，见图1。生物信息学分析显示，ALDH1A1与miR-140-5p存在靶向结合位点，见图2。

图1 91例HCC患者组织中ALDH1A1 mRNA表达水平与miR-140-5p的相关性

图2 miRTarBase预测ALDH1A1与miR-155的靶向结合位点

四、化疗耐药组与敏感组临床特征比较

化疗耐药组、化疗敏感组患者在性别、肿瘤分化程度、年龄、肿瘤直径、是否合并肝炎、肿瘤部位方面差异无统计学意义(P>0.05)，而在肿瘤数目、血清AFP水平、HCC组织ALDH1A1 mRNA、miR-140-5p表达水平方面，差异有统计学意义(P<0.05)，且化疗敏感组肿瘤多发、AFP≤ 20 μg/L、ALDH1A1 mRNA≤1.97、miR-140-5p> 0.50的患者高于化疗耐药组(P<0.05)。见表3。

五、logistic回归分析HCC化疗敏感的影响因素

单因素logistic回归分析显示，肿瘤数目、血清AFP、ALDH1A是影响HCC患者化疗敏感的危险因素(P<0.05)，miR-140-5p是影响HCC患者化疗敏感的保护因素(P<0.05)；多因素logistic回归分析结果显示，ALDH1A是影响HCC患者化疗敏感的独立危险因素(P<0.05)，miR-140-5p是影响HCC患者化疗敏感的独立保护因素(P<0.05)。见表4。

表3 HCC患者化疗耐药组与化疗敏感组临床特征比较[例(%)]

表4 影响HCC化疗敏感性的logistic回归分析

讨 论

HCC血管多、恶性程度高、易转移，多数患者就诊时已处于中晚期[9-10]。中晚期HCC患者多以TACE化疗为主，TACE虽然可改善部分HCC患者生存状况，但部分患者因产生耐药导致化疗效果较差[11-12]。ALDH1A1可参与细胞分化、血管生成、影响肿瘤细胞耐药性，可通过影响DNA修复进而调节肿瘤细胞的治疗抗性[13-14]。研究发现，ALDH1A1在胃癌中表达上调，与肿瘤侵袭及预后相关，其可能在胃癌中发挥促癌作用[15-16]。本研究中HCC组织ALDH1A1 mRNA表达水平较高，与Ualcan数据库检索结果相符，提示ALDH1A1表达失调可能与HCC发生发展相关，推测高表达ALDH1A1通过促进血管生成，影响癌细胞浸润、转移，进而影响HCC病变进程。Gong等[17]研究发现ALDH1A1可经miR-625靶向调节后，进而影响胃癌细胞的多药耐药性。本研究显示，化疗敏感组ALDH1A1 mRNA≤1.97的患者占比较高，提示ALDH1A1表达水平与HCC患者化疗敏感性密切相关，其表达水平越低，HCC患者化疗越敏感，ALDH1A1有望成为评估HCC患者化疗效果的辅助指标。

miRNA可在自噬、细胞增殖、凋亡等过程中发挥调控作用，其与肿瘤病理变化关系密切[18-19]。miR-140-5p在黑色素瘤中呈低表达，其可通过靶向结合相关基因，调节NF-κB等信号通路从而影响黑色素瘤发展过程[20-21]。本研究显示，HCC组织miR-140-5p表达水平较低，提示miR-140-5p在HCC中具有重要调节作用。既往研究显示，miR-140-5p可靶向调节有关基因表达，影响自噬，从而影响骨肉瘤细胞的化疗敏感性，其可能是治疗骨肉瘤化疗耐药的潜在靶标[22]。本研究中化疗敏感组miR-140-5p>0.50的HCC患者占比较高，提示miR-140-5p可能与HCC患者化疗敏感性有关，其表达水平越高，HCC患者TACE越敏感，推测miR-140-5p可能通过靶向调节相关基因表达，影响自噬、HCC细胞侵袭能力和糖酵解过程，从而影响HCC患者TACE的治疗作用，其机制仍需深入探讨。

本研究发现HCC组织中miR-140-5p水平与ALDH1A1 mRNA呈负相关，提示miR-140-5p、ALDH1A1 mRNA可能共同影响HCC进展，至于二者是否共同影响HCC患者化疗敏感性有待结合基础研究加以证实。此外，化疗敏感组中血清AFP水平≤ 20 μg/L的HCC患者占比较高，与孙晗等[23]研究结果相符。AFP可能通过调节耐药基因表达，抑制细胞凋亡等进而影响HCC化疗效果。进一步研究发现，HCC组织中ALDH1A表达水平升高，miR-140-5p表达水平降低均可能会降低HCC患者化疗敏感性，使HCC患者TACE治疗效果较差，测定HCC组织中ALDH1A、miR-140-5p表达水平有助于及早判定HCC患者化疗敏感性，选择更佳治疗方案。

综上，HCC组织中ALDH1A1表达上调，miR-140-5p表达下调，ALDH1A1、miR-140-5p均与化疗敏感性相关，可作为判断HCC患者化疗效果的指标。但本研究样本较少，后期需扩大样本量从多角度探究ALDH1A1、miR-140-5p表达与HCC患者化疗敏感性的关系，为临床预防化疗耐药提供依据。