生物反应器悬浮培养禽偏肺病毒制备弱毒疫苗工艺的优化

蒋天华，周庆丰，严专强，周展

1.浙江大学药学院，浙江 杭州 310058；2.温氏食品集团股份有限公司，广东 云浮 527439

aMPV可在多种原代和传代细胞内增殖，PATNAYAK等［14］比较了aMPV疫苗毒株在BHK-21、Vero、BGM-70、MA-104、McCoy、DF-1、QT-35和 火 鸡 原 代CEF中的增殖情况，发现这8种细胞均能很好地适应aMPV的培养。本研究采用分批培养的方法探讨悬浮BHK-21细胞在生物反应器内培养及aMPV增殖的工艺，优化生物反应器内BHK-21细胞培养及aMPV增殖的工艺参数，并对制备的疫苗进行动物安全性和攻毒保护试验，以期为aMPV减毒活疫苗的研发及生产奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1细胞及病毒 BHK-21悬浮细胞由上海倍谙基生物科技有限公司提供；aMPV S-01（传代致弱毒株）和BL强毒株由温氏食品集团股份有限公司保存。

1.2实验动物3日龄雏番鸭购自广东省开平市某公司，检测无APV母源抗体；40周龄产蛋番鸭购自温氏集团股份有限公司种鸭场，产蛋正常，无异常症状。

1.3主要试剂及仪器 BHK细胞无血清培养基Tac-S101S购自上海倍谙基生物科技有限公司，使用超纯水配制成细胞培养液，经无菌0.22μm滤膜过滤除菌，置4℃备用；BC-7L、BC-20L和BC-200L生物反应器购自广州齐志生物工程设备有限公司；全自动细胞计数仪JSY-SC-031购自深圳博大博聚科技有限公司。

1.4生物反应器悬浮培养BH K-21细胞及aM PV工艺的优化

1.4.1初始细胞接种密度的优化 常规复苏BHK-21悬浮细胞，接种摇瓶内，置振荡培养箱培养，细胞密度达5.0×106cells/mL时，按不同初始细胞密度5.0×105、8.0×105和1.0×106cells/mL接种BC-7L生物反应器，培养条件均为转速60 r/min，溶氧饱和度50%，温度37℃，pH 7.1。培养3 d，期间每12 h取样，观察不同初始细胞接种量下细胞的生长情况。

1.4.2病毒接种剂量的优化 BC-7L生物反应器内细胞生长密度达3.0×106cells/mL后，向生物反应器内添加培养液，调整细胞密度为1.0×106cells/mL，分别按MOI=0.01、0.05和0.10接种aMPV S-01弱毒株，培养条件均为转速60 r/min，溶氧饱和度50%，温度37℃，pH 7.1。培养4 d，期间每12 h取样，观察不同病毒接种剂量下细胞的生长情况。

1.4.3病毒接种条件的优化 通过L9（33）正交试验确定S-01弱毒株最适接种条件，试验因素水平见表1。BC-7L生物反应器内细胞生长密度达3.0×106cells/mL后，向生物反应器内添加培养液，调整细胞密度为对应的密度条件，使用二氧化碳和碳酸氢钠溶液调节pH为对应条件，按表1中不同MOI接种病毒。1 h后培养条件设为转速60 r/min，溶氧饱和度50%，温度37℃，pH 7.1。培养4 d，期间每12 h取样，观察细胞状态，并留样检测病毒效价。以病毒最高效价为指标，效价越高，表示病毒接种条件越优。

白鹫习惯了天空，在这种战斗下，它们是处于劣势的。但它们仍然不肯离去，只护在女子的上空，不时俯冲下来，与周围的土狼死拼。

表1 病毒接种条件的正交试验设计Tab.1 Orthogonal test design of condition for virus inoculation

1.4.4最佳病毒接种条件的验证及最佳收毒时间的优化 在BC-7L生物反应器内采用1.4.3项得出的最佳病毒接种条件进行病毒接种验证试验，病毒接种后培养4 d，期间每12 h取样，观察细胞状态，并留样检测病毒效价。

1.5200 L生物反应器放大培养 BHK-21细胞经摇瓶和BC-7L生物反应器放大后，按最佳初始细胞接种密度逐级导入BC-20L和BC-200L生物反应器继续放大培养，按1.4.4项经BC-7L生物反应器验证过的最佳病毒接种条件进行200 L生物反应器规模验证，接种病毒后培养4 d，期间每12 h取样，观察细胞状态，并留样检测病毒效价。

1.6aM PV S-01株弱毒疫苗的制备 将病毒培养液离心，收取上清即为弱毒疫苗，根据免疫剂量用生理盐水稀释备用。

1.7aM PV致弱株毒力返强试验 将10只体型相近、性别相同的3日龄雏番鸭通过点眼滴鼻接种S-01株弱毒疫苗，105.5TCID50/羽份。接种96 h后随机扑杀5只，观察病理变化，留存气管和肺脏等组织样本供下一次传代使用，扑杀后留存5只，继续隔离饲养观察。使用上一代组织病料研磨液再通过点眼滴鼻接种10只3日龄雏番鸭，0.2 mL/羽份，如此共进行5次回归传代。取第1和第5代试验鸭气管和肺脏组织进行病理组织学检查，同时对组织样品进行病毒再分离，分离的病毒样品送华大基因测序公司测序，序列使用DNASTAR和MEGA 7.0软件进行对比和分析［15］。

1.8动物安全性试验 将20只体型相近的40周龄产蛋番鸭随机分成2组，10只/组，A组通过点眼滴鼻、肌注和泄殖腔导入同时接种aMPV S-01株弱毒疫苗，105.5TCID50/羽份；B组为空白对照组。接种后3周内每天观察临床症状，并记录产蛋情况，评价疫苗的安全性。

1.9动物攻毒保护试验 将30只体型相近、性别相同的1日龄雏番鸭随机分为3组，10只/组，A组于1和15 d点眼滴鼻接种aMPV S-01株弱毒疫苗，105.5TCID50/羽份；B组同时点眼滴鼻接种相同剂量的细胞培养基溶液；C组为空白对照组。接种后28 d各组分别经肌肉注射aMPV BL强毒株，观察21 d，记录疫苗保护情况。

1.10细胞计数和病毒效价测定 采用JSY-SC-031全自动细胞计数仪测定细胞密度；测定按照《中华人民共和国兽药典》三部（2015版）附录27方法检测接毒后样品效价（TCID50）。

2 结果

2.1生物反应器悬浮培养BH K-21细胞及aM PV工艺的优化

2.1.1初始细胞接种密度的优化 3种不同初始细胞密度接种BC-7L生物反应器，初始接种密度为5.0×105cells/mL时，细胞延滞期较长，48 h后开始进入指数生长期；初始接种密度为8.0×105cells/mL时，细胞延滞期较短，12 h后开始进入指数生长期；初始接种密度为1.0×106cells/mL时，细胞快速进入指数生长期，72 h后密度可达1.6×107cells/mL。见图1。细胞在生物反应器内接种或传代时，保持密度高于1.0×106cells/mL有利于细胞快速增殖。

图1 不同初始接种密度BHK-21细胞生长曲线的比较Fig.1 Growth curves of BHK-21 cells at different initial densities

2.1.2病毒接种剂量的优化 3种剂量接种病毒后，细胞均能继续生长，MOI=0.01时，细胞于接种病毒后60 h开始停止生长，密度达最高，为8.2×106cells/mL；MOI=0.05时，细胞于接种病毒后48 h开始生长减缓，其后细胞量小幅增长，84 h密度达最高，为6.1×106cells/mL；MOI=0.10时，细胞于接种病毒后48 h开始停止生长，最高密度为5.6×106cells/mL。见图2。细胞接种病毒后24 h内正常生长，24 h后细胞生长受到不同程度的抑制，接种病毒剂量越大，对细胞生长抑制越明显。

图2 接种不同剂量病毒后BHK-21细胞生长曲线的比较Fig.2 Growth curves of BHK-21 cells inoculated with aMPV at different MOIs

2.1.3病毒接种条件的优化 L9（33）正交试验结果见表2。极差分析表明，影响因素大小依次为病毒接种剂量＞病毒接种pH＞细胞密度，最佳病毒接种条件组合为：细胞密度3.0×106cells/mL，病毒接种剂量MOI=0.10，病毒接种pH 6.8。

表2 病毒接种条件正交试验结果Tab.2 Orthogonal test results of condition for virus inoculation

2.1.4最佳病毒接种条件的验证及最佳收毒时间的优化 BC-7L生物反应器规模最佳病毒接种条件验证结果见图3，72 h病毒效价最高，峰值为108.67TCID50/mL，符合预期。

图3 7 L和200 L生物反应器接种病毒后病毒滴度比较Fig.3 Titers of viruses cultured in 7 L and 200 L bioreactors

2.2200 L生物反应器培养规模验证 BC-200L生物反应器规模验证结果见图3，84 h病毒效价最高，峰值为108.50TCID50/mL，与BC-7L生物反应器规模结果基本一致，符合预期。2.3aM PV致弱株毒力的稳定性 5代毒力返强试验结果显示，各代次病毒攻毒后，鸭只均未出现咳嗽、气管啰音等临床症状，剖检发现雏鸭鼻腔清亮无黏液，内脏器官正常，气管和肺脏切片未见明显病理变化，见图4。序列同源性比对发现，第1代与第5代毒株核苷酸序列同源性为99.9%以上。核苷酸序列仅发生了11个突变，其中主要抗原基因F发生2个突变，抗原基因G发生1个突变，均为无义突变。见图5。

图4 显微镜观察雏鸭攻毒后肺脏（A）及气管（B）的病理变化Fig.4 Pathological change of lung（A）and trachea（B）of ducklings after virus challenge

图5 F基因核苷酸序列推导的氨基酸序列比对情况Fig.5 Comparison of amino acid sequences deduced from nucleotide sequence of F gene

2.4动物安全性 2组动物观察期内食欲和精神状况良好，产蛋正常，未表现出任何临床症状，表明S-01株弱毒疫苗具有良好的安全性。

2.5动物攻毒保护效果 攻毒后7 d，B和C组动物出现典型的aMPV感染症状，保护率为0%；A组在整个试验周期内均未出现明显的临床症状，保护率为100%。

3 讨论

aMPV自20世纪70年代末在南非被发现以来，已在世界大部分地区被发现，对家禽业造成重大经济损失［16-17］。疫苗接种是预防aMPV感染的有效方法，国外已有aMPV灭活疫苗和减毒活疫苗上市，但我国至今仍无上市疫苗。

机械搅拌式生物反应器已应用于生物制品生产，本实验在7 L机械搅拌式生物反应器中对aMPV悬浮培养工艺条件进行了优化，结果表明，细胞接种密度对细胞生长影响较大，初始接种密度低于1.0×106cells/mL时，细胞会经历一段较长的延滞期；初始接种密度为1.0×106cells/mL时，延滞期不明显，细胞快速进入指数期生长，72 h后密度可达1.6×107cells/mL。细胞在生物反应器内接种或传代时，保持密度高于1.0×106cells/mL对于维持细胞活性状态，提高生产效率具有重要意义。细胞被病毒感染后，由于病毒在细胞内复制，细胞正常分裂生长会受到抑制并逐渐死亡。aMPV按不同剂量感染BHK-21细胞后，细胞仍能维持一段时间的对数期生长，24 h后细胞生长逐渐受到抑制，接种病毒剂量越大，对细胞生长的抑制作用越明显。比较各组最高细胞密度，为保证细胞活性和营养供给，接种病毒时细胞密度不宜超过3.0×106cells/mL。贠炳岭［18］比较了低pH对不同亚型aMPV中F蛋白融合活性的影响，发现低pH环境能促进aMPV/CF蛋白活性，细胞数量和病毒接种剂量是影响病毒增殖后效价的重要因素。本研究通过L9（33）正交试验筛选出最佳病毒接种条件组合为：细胞密度3.0×106cells/mL，病毒接种剂量MOI=0.10、病毒接种pH 6.8，经验证，在该条件下，病毒效价最高可达108.67TCID50/mL。反应器规模放大后，搅拌带来的剪切力会相应提高，随着体积增加，均一性变差，部分区域参数超出控制范围，经常会出现细胞生长变缓、活率降低和生产效率下降等问题，严重者甚至会使工艺放大失败［19］。本研究将7 L生物反应器上的运行和操作参数逐级复制放大至新反应器系统上，以病毒效价为指标，考察在200 L生物反应器上运行情况，病毒效价最高可达108.50TCID50/mL，与7 L生物反应器上结果基本一致。毒力返强试验结果表明，S-01株弱毒疫苗对敏感雏番鸭无致病性，毒力遗传性稳定。动物安全性试验结果表明，疫苗安全性良好，不会引起产蛋番鸭染病和严重不良反应。动物攻毒保护试验结果表明，疫苗可有效免疫雏番鸭。

综上所述，本研究对生物反应器内aMPV增殖和放大工艺进行了优化，为aMPV减毒活疫苗的研制及进一步工业化生产提供了参考。