陶瓷羟基磷灰石层析法纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖

高磊，苏晓叶，石献华，程亚君，张荣锋，李倩，刘刚

北京智飞绿竹生物制药有限公司生产管理部，北京 100176

流感嗜血杆菌为革兰阴性菌，是引起小儿严重细菌感染的主要致病菌［1］，其中b型流感嗜血杆菌引起的病例最多，占95%左右。目前，利用b型流感嗜血杆菌多糖制备的多糖-蛋白结合疫苗被证明具有良好的安全性和有效性。我国自1997年开始接种b型流感嗜血杆菌结合疫苗以来，b型流感嗜血杆菌引起的呼吸道感染呈下降趋势［2］。

多糖的生产工艺包括发酵、粗制、精制3个工序。其中传统的b型流感嗜血杆菌多糖精制工序与肺炎球菌多糖、脑膜炎球菌多糖、伤寒沙门菌多糖一样采用苯酚抽提去除蛋白的方法，但苯酚对人体及环境存在较大危害。随着科技的进步，其他萃取溶剂、酶解法、超滤、色谱层析已被用于多糖的纯化过程中。有报道将TritonX-114等表面活性剂用于b型流感嗜血杆菌多糖的萃取［3］；也有报道通过核酸酶、蛋白酶酶解以及切向流超滤获得b型流感嗜血杆菌多糖［4-6］；同时，现已利用层析技术成功纯化获得A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖［7］，通用电气公司等利用层析柱开发了23价肺炎球菌多糖疫苗层析纯化工艺［8-10］。但利用层析法进行b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化的报道较少。而羟基磷灰石可通过钙离子金属亲和性作用和磷酸离子的阳离子作用结合蛋白［11-12］，被广泛应用于单克隆抗体的纯化［13］。本研究利用陶瓷羟基磷灰石（ceramic hydroxyapa tite，CHT）层析法纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖，以代替传统的苯酚抽提法。

1 材料与方法

1.1多糖样品 b型流感嗜血杆菌粗多糖由本公司发酵生产。

1.2主要试剂及仪器 AKTA pure系统和XK16/10层析柱为美国GE公司产品；CHT为美国伯乐公司产品；50 KD膜包为默克化工技术有限公司产品；其他试剂均为国药集团化学试剂有限责任公司产品。

1.3粗多糖溶解 称量500 mg b型流感嗜血杆菌粗多糖，用5 mmol/L PB溶液溶解至终浓度10 g/L，搅拌1 h左右至多糖完全溶解，置2～8℃冰箱保存备用。

1.4工艺路线的筛选 粗多糖溶解后，采用不同方案进行粗多糖纯化，见表1。

表1 不同试验方案步骤Tab.1 Procedures of various protocols

1.4.1层析前乙醇沉淀 向溶解后多糖溶液中加入乙醇至终浓度35%，混匀，使用大容量冷冻离心机6 000×g离心60 min；取上清，补加乙醇至终浓度80%，混匀，用大容量冷冻离心机6 000×g离心60 min；取沉淀，用5 mmol/L PB溶液溶解至终浓度1 g/L，置2～8℃冰箱保存备用。

1.4.2层析前切向流超滤 使用0.1 m2，50 KD超滤膜包，以5 mmol/L PB溶液作为补充液，对粗多糖溶解或层析前乙醇沉淀中溶液进行超滤，至原体积的1/10，重复10次。

1.4.3CHT层析 向CHT层析柱中加入30 mL浓度为1 g/L的多糖溶液，以200 cm/h的流速进行层析，收集流穿的层析液。

1.4.4层析后切向流超滤 使用0.1 m2，50 KD超滤膜包，以纯化水作为补充液，对CHT层析中收集的层析液进行超滤，至原体积的1/10，重复10次。

1.4.5层析后乙醇沉淀 向层析后切向流超滤后的多糖溶液中加入乙醇至终浓度为25%，混匀，用大容量冷冻离心机6 000×g离心60 min；取上清，加入乙醇至终浓度为80%，混匀，用大容量冷冻离心机6 000×g离心60 min；收取沉淀。

1.4.6冻干 将收获的溶液于-20℃条件下预冻干8 h；在-50℃、压力为50 Pa条件下冻干48 h，收集固体粉末。

1.4.7磷、蛋白、核酸、核糖含量及多糖分子大小检测 按照《中国药典》三部（2015版）［14］方法进行检测。

1.5工艺路线的优化

1.5.1乙醇沉淀条件 对选择的多糖纯化路线中乙醇沉淀步骤的乙醇含量进行优化。取溶解后多糖溶液，按1.4.1项分别加乙醇至终浓度为5%、15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%进行沉淀，沉淀用纯化水溶解后，检测蛋白及核糖含量。

1.5.2切向流超滤条件 对选择的多糖纯化路线中切向流超滤次数进行优化。按1.4.2项中条件进行切向流超滤，每次超滤后，取样检测蛋白、核酸、核糖含量及电导率值。

1.5.3CHT层析条件 以蛋白去除率为响应条件，对CHT层析条件中的柱高、缓冲液离子浓度、缓冲液pH进行响应面分析，见表2。层析后取流穿样，检测蛋白含量。

表2 响应面分析因素与水平Tab.2 Factors and levels in response surface analysis

2 结果

2.1工艺路线的选择 试验结果显示，粗多糖直接进行CHT层析（方案1），多糖与蛋白同时流穿，见图1A；通过切向流超滤后层析（方案2），多糖流穿而蛋白与CHT层析柱结合，见图1B。方案1获得多糖的蛋白含量降至54.32 mg/g，相比于粗多糖仅降低了63.4%；而方案2获得多糖的蛋白含量降至15.64 mg/g，蛋白去除率可达89.4%。因此，粗多糖在CHT层析前应进行切向流超滤，可有效增强CHT对粗多糖中蛋白的结合，但未达到药典要求（＜10 mg/g）。层析后进行乙醇沉淀（方案3），多糖中蛋白含量相比于方案2稍微降低，蛋白含量为12.57 mg/g，但回收率仅为11.63%。在切向流超滤前增加乙醇沉淀（方案4），可进一步降低蛋白含量至8.75 mg/g，满足药典标准，且回收率均保持在20%以上。见表3。因此选择方案4作为b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化路线。

表3 不同试验方案多糖成分的比较Tab.3 Purification of polysaccharides by various protocols

图1 直接层析（A）与切向流超滤后层析（B）图谱Fig.1 Profiles of direct chromatography（A）and postultrafiltration tangential flow chromatography（B）

2.2工艺路线的优化

2.2.1乙醇沉淀条件 试验结果显示，乙醇含量为35%时，蛋白沉淀率可达27.2%，多糖沉淀率仅为2.6%；乙醇含量为80%时，多糖沉淀率可达76.7%，蛋白沉淀率为62.9%。见图2。因此选择乙醇沉淀条件为：用35%乙醇沉淀去除蛋白，离心取上清后，用80%乙醇沉淀收集多糖。

图2 不同乙醇含量对多糖和蛋白沉淀率的影响Fig.2 Effects of ethanol at different concentrations on precipitation rates of polysaccharide and protein

2.2.2切向流超滤条件 试验结果显示，超滤次数≥8时，蛋白含量可降至27.9μg/mL，去除率达81.1%，核酸去除率达86.1%，多糖（即核糖含量）仅损失18.9%，而且对CHT层析影响较大的盐离子可大部分脱除，脱盐率达89.0%。见图3。考虑到工艺的可靠性，超滤次数定为10次。2.2.3CHT层析条件 试验结果显示，离子浓度在5~15 mmol/L、pH 6.7~7.7之间变化，对蛋白去除率影响较低，柱高提高可增强蛋白去除率；在低pH、低离子浓度下，蛋白去除率较高。见图4和表4。确定最适CHT条件为：柱高24 cm，PB浓度5 mmol/L，pH 6.7，该步骤蛋白去除率可达86%以上。

图3 超滤对多糖成分的影响Fig.3 Effect of ultrafiltration on polysaccharide component

表4 条件优化响应面试验方案及结果Tab.4 Design and result of response surface test under optimized condition

图4 柱高、离子浓度及pH对蛋白去除率的影响Fig.4 Effects of pH，ion concentration and column height on protein removal rate

2.3工艺路线的确定 根据工艺路线选择及优化结果，确定如下工艺路线：将b型流感嗜血杆菌粗多糖溶解后经35%和80%浓度乙醇沉淀2次，沉淀物溶解后，经切向流超滤10次，CHT层析收获流穿液，再经切向流超滤后冻干。最终获得的b型流感嗜血杆菌多糖质量符合《中国药典》三部（2015版）要求，见表5。

表5 纯化多糖成分表Tab.5 Ingredients of purified polysaccharide

3 讨论

当前，b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化一直沿用苯酚抽提工艺。苯酚会对操作人员及环境造成危害，疫苗中残留也会对疫苗使用者造成潜在威胁。本研究使用CHT层析纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖，避免了苯酚的使用。经超滤后，低离子浓度下的多糖与CHT不结合而流穿，蛋白质、核酸由于阳离子交换作用以及钙离子螯合作用结合在CHT层析柱上，实现了多糖的纯化。CHT结构为钙离子与磷酸离子，相较于苯酚具有环保、安全的优势。层析过程可通过检测器进行实时监测，避免了传统抽提工艺无法在线监测的问题；且自动化程度高，降低了批间差异。因此，使用CHT层析法纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖具有重要的社会价值。

本研究使用CHT层析法纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖，成功获得了各项质量指标均符合《中国药典》三部（2015版）要求的多糖。但由于CHT与蛋白的结合能力相较于常规离子层析柱弱，该纯化过程仍需乙醇沉淀加强蛋白的去除。乙醇作为易燃物，对生产厂房及设备要求严格。因此，为进一步优化工艺，减少易燃易爆，易腐蚀溶剂的使用，还需进一步研究，以期实现b型流感嗜血杆菌荚膜多糖生产的无毒无害工艺。