维持性血液透析所致继发性甲状旁腺功能亢进患者血清可溶性Klotho蛋白和成纤维细胞生长因子23含量及临床意义▲

廖 琳 胡 静 陈 杰 张传富 刘文瑞 刘伟伟 郭 玥 段连香 路建饶

(上海市第七人民医院肾病科，上海市 200137，电子邮箱：shliaolin85@163.com)

继发性甲状旁腺功能亢进症(secondary hyperparathyroidism,SHPT)是行维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)的慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患者常见并发症之一，是维生素D缺乏、钙磷代谢异常，刺激甲状旁腺过度分泌甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)的结果[1]。SHPT可致MHD患者发生血管钙化，增加心血管疾病的发生率和病死率，需引起重视[2]。研究显示，早期诊断并及时干预SHPT可有效改善MHD患者的预后，延长患者的寿命[3]。成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF-23)属于成纤维细胞生长因子家族成员之一，主要由骨细胞和成骨细胞合成和分泌，与钙、磷及骨代谢的调节密切相关[4]。有学者发现，过表达FGF-23可增加小鼠的尿磷排泄，使其患SHPT，主要表现为低磷血症、佝偻病和骨软化等[5]。这提示FGF-23是导致SHPT发生和发展的重要因素，但其临床价值目前尚不明确。Klotho是一种衰老相关基因，于1997年被Kuro-o等学者首次发现[6]。研究显示，Klotho基因缺陷小鼠和FGF-23基因缺陷小鼠表现出相似的表型，提示二者可能具有相同信号通路；此处Klotho蛋白可作为FGF-23的受体辅助因子参与钙、磷、维生素D和PTH等的代谢[7-8]。但关于Klotho蛋白和FGF-23在MHD所致SHPT中的临床价值，目前的研究仍较少。本研究选取260例MHD患者作为研究对象，根据患者是否并发SHPT将其分为非SHPT组和SHPT组，探讨患者血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量及临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月至2019年6月于本院进行MHD的260例患者作为研究对象。纳入标准：(1)符合第8版《内科学》[9]中有关于MHD治疗的指征；(2)透析时间>6个月,每周透析2～3次，过程顺利。排除标准：(1)合并原发性甲状旁腺功能障碍；(2)有甲状旁腺手术史；(3)有心血管疾病史；(4)合并恶性肿瘤。此外，对于合并SHPT的患者，须排除具有骨营养不良、严重骨痛、严重高钙血症等符合甲状旁腺手术指征者，以及入组前已接受SHPT相关治疗者。所有患者根据是否并发SHPT分为非SHPT组(n=110)和SHPT组(n=150)。SHPT诊断标准符合中华医学会肾脏病专业委员会编制的《CKD继发性甲状旁腺功能亢进专家共识》[10]，即全段甲状旁腺激素(intact parathyroid hormone,iPTH)>120 pg/mL。非SHPT组中男性60例、女性50例，患者年龄(58.23±4.91)岁，原发病为慢性肾小球肾炎69例、高血压肾病21例、糖尿病肾病20例；SHPT组中男性80例、女性70例，患者年龄(58.91±5.12)岁，原发病为慢性肾小球肾炎90例、高血压肾病30例、糖尿病肾病30例。两组患者性别、年龄及原发病比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究所有研究对象均签署知情同意书，并通过本院伦理委员会批准。

1.2 治疗方法 所有患者均采用日本TORAY公司TS-1.3S型透析器进行透析，每周3次，每次透析时间4 h，其中透析液购自河北紫薇山制药有限公司，透析液流量为500 mL/min，抗凝剂为低分子肝素钠，血流量为220～250 mL/min，每次超滤量为0.5～4.0 L。SHPT组患者接受低磷饮食，并在透析结束后给予骨化三醇(上海罗氏制药有限公司，国药准字J20150011)冲击疗法，具体用量根据患者iPTH水平调整：(1)当iPTH水平>1 000 pg/mL时，骨化三醇2.0～4.0 μg/次，每周2次；(2)当iPTH水平在600～1 000 pg/mL时，骨化三醇1.0～2.0 μg/次，每周2次；(3)当iPTH水平在150～599 pg/mL时，骨化三醇0.5～1.5 μg/次，每周2次；(4)当iPTH水平<150 pg/mL时，逐步停药。两组患者均连续治疗12周。

1.3 观察指标

1.3.1 血清指标：收集所有患者入组后第1天的空腹外周血5 mL，4 000 r/min离心10 min，取上清保存于抗凝管中，-80℃冰箱保存，待标本集齐后检测。采用酶联免疫吸附法检测血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司(批号：201905、201903)，具体操作参考试剂盒说明书；使用Multiskan Sky型全自动酶标仪(美国Thermo Fisher公司)测定450 nm波长处的吸光度值，绘制曲线，计算待测指标含量。

1.3.2 疗效评价：根据SHPT患者治疗前、治疗12周后血清iPTH水平变化幅度进行评价[11]，分为显效、有效和无效3个等级。其中，显效指iPTH水平下降幅度≥75%；有效指iPTH水平下降幅度≥25%但<75%；无效指iPTH水平下降幅度<25%，甚至出现反向升高。将“显效”者和“有效”者纳入临床有效组(共120例)，其余患者纳入临床无效组(共30例)。

1.3.3 血管钙化检查：入组后每3个月采用X线检查SHPT患者主动脉弓和腹主动脉的血管钙化情况，并由同一经验丰富的放射科医师进行诊断[12]。其中主动脉弓和腹主动脉任一血管存在钙化即可诊断为血管钙化。

1.3.4 随访：从入组时对SHPT患者进行随访，截止日期为2020年10月，收集终点事件发生情况，按照有无血管终点事件将其分为终点事件组(n=34)和无终点事件组(n=116)。终点事件包括心肌梗死、因充血性心力衰竭住院、卒中和心脏猝死。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计数资料以例数和百分比表示，比较采用χ2检验；计量资料以(x±s)表示，比较采用独立样本t检验。采用Spearman秩相关检验进行相关性分析；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量对SHPT诊断和疗效评估的价值。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 SHPT组和非SHPT组血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比较 SHPT组血清可溶性Klotho蛋白含量低于非SHPT组，而血清FGF-23含量高于非SHPT组(均P<0.05)。见表1。

表1 SHPT组和非SHPT组血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比较(x±s，ng/L)

2.2 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量诊断MHD患者发生SHPT的价值 ROC曲线结果显示，血清可溶性Klotho蛋白、FGF-23含量诊断MHD患者发生SHPT的曲线下面积分别为0.822(95%CI：0.764，0.873；P=0.007)、0.803(95%CI：0.745，0.867；P=0.009)；约登指数最大时，血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的最佳截断值分别为268.32 ng/L、81.46 ng/L，灵敏度分别为75.3%和73.9%，特异度分别为78.4%和76.5%。见图1。

图1 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量诊断MHD患者发生SHPT的ROC曲线

2.3 临床有效组和临床无效组SHPT患者血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比较 SHPT患者中，临床有效组血清可溶性Klotho蛋白含量高于临床无效组，血清FGF-23含量低于临床无效组(均P<0.05)。见表2。

表2 临床有效组和临床无效组SHPT患者血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比较(x±s,ng/L)

2.4 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量对SHPT患者疗效的预测价值 ROC曲线结果显示，血清可溶性Klotho蛋白、FGF-23含量预测SHPT患者疗效的曲线下面积分别为0.783(95%CI：0.711，0.835；P=0.016)、0.762(95%CI：0.701，0.815；P=0.019)；约登指数最大时，血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的最佳截断值分别为220.28 ng/L、138.93 ng/L，灵敏度分别为72.1%和70.4%，特异度分别为74.3%和73.1%。见图2。

图2 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量预测SHPT患者疗效的ROC曲线

2.5 血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量与SHPT患者发生血管钙化的相关性 相关分析结果显示，SHPT患者发生血管钙化与血清可溶性Klotho蛋白含量呈负相关(rs=-0.392,P=0.005)，与血清FGF-23含量呈正相关(rs=0.475,P<0.001)；血清可溶性Klotho蛋白含量与血清FGF-23含量呈正相关(rs=0.581,P<0.001)。

2.6 终点事件组和无终点事件组血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比较 在SHPT患者中，无终点事件组血清可溶性Klotho蛋白含量高于终点事件组，血清FGF-23含量低于终点事件组(均P<0.05)。见表3。

表3 终点事件组和无终点事件组血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量的比较(x±s，ng/L)

3 讨 论

近年来，随着人们生活方式及习惯发生明显改变，慢性肾功能不全患病率急剧上升，成为威胁人们生命健康的重要疾病之一[13]。目前，MDH仍是终末期肾脏病患者的主要治疗方式，在延长患者生命方面占有重要地位[14]。长期进行MHD的患者多存在矿物质和骨代谢紊乱，大多数患者可相继出现SHPT；除PTH和钙磷代谢紊乱外，SHPT的临床表现还包括失眠、皮肤损伤、骨相关疾病及心血管系统损伤，而心血管系统损伤是影响患者预后的重要因素[15]。有研究显示，在CKD患者中，心血管疾病相关死亡病例占总死亡病例的44%～51%，尸检发现几乎所有因心血管疾病死亡的患者均存在不同程度血管钙化，提示血管钙化对MHD患者的心血管病发生和死亡有很强的预测作用[16]。有学者发现，PTH水平升高是终末期肾脏疾病患者发生血管钙化的重要促动因素，但其无法早期预测SHPT发生[17]。因此，寻找更多灵敏且有价值的血清学指标对于评估MHD所致SHPT十分必要。

FGF-23是内分泌性成纤维细胞生长因子家族的重要成员之一，主要由骨细胞和成骨细胞调节合成和分泌，是一种由251个氨基酸组成的、相对分子量为320 000的蛋白,其编码基因位于人第12号染色体上[18]。目前研究证实，FGF-23主要通过介导骨-肾-甲状旁腺轴参与骨矿物质代谢的调控[19]。有学者发现，FGF-23水平可随着肾小球滤过率降低而增加，在CKD早期阶段(2期和或3期)，甚至在血磷、1,25-二羟维生素D3及PTH未出现异常改变前，血清FGF-23水平已经升高了，这提示与以上常见指标比较，FGF-23具有更高的灵敏性，可作为早期诊断CKD并发症的高灵敏性指标[20]。

人Klotho基因位于第13号染色体12长臂区域，长约50 kbp，由4个内含子和5个外显子组成，但在第3个外显子区域有1个内在选择性剪切位点，根据此位点上是否插入50 bp片段将Klotho基因编码的蛋白分为膜型Klotho蛋白和可溶性Klotho蛋白。可溶性Klotho蛋白又名分泌型或循环型Klotho蛋白，相对分子量为130 000，主要存在于血液、尿液及脑脊液中，以游离形式发挥生物学效应，相对于膜型Klotho蛋白，其更容易检测，因此更适用于临床研究[21]。可溶性Klotho蛋白来源主要有：Klotho基因直接编码；膜型Klotho蛋白水解片段直接脱落入血；膜型Klotho蛋白经Na+/K+-ATP酶介导从内质网和高尔基体上转移至细胞膜表面后被水解入血[22]。Klotho蛋白具有β-葡糖醛酸酶活性，可通过调解瞬时受体电位香草酸亚型1(肾脏远曲小管上皮细胞膜上的钙离子通道)增加肾脏对钙离子重吸收，以维持正常血钙浓度；其还可依赖或不依赖FGF-23抑制肾近端小管对磷的重吸收，避免并发高磷血症[21]。此外，Klotho蛋白还可作为一种激素作用于全身各组织器官发挥抗衰老、调节血压、保护心血管及避免肾脏纤维化等作用[23]。CKD特别是尿毒症患者的Klotho蛋白表达水平明显低于健康人群，且随CKD进展Klotho蛋白表达相应减少；同时，可溶性Klotho蛋白减少可诱发或加重心血管钙化等，可能增加CKD合并SHPT患者的不良预后[24]。

在本研究中，SHPT组血清可溶性Klotho蛋白含量低于非SHPT组，而血清FGF-23含量则高于非SHPT组，同上述研究的结论基本吻合，说明可溶性Klotho蛋白和FGF-23在MHD所致SHPT患者血清中表达异常。进一步行ROC曲线分析发现，血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量对MHD患者发生SHPT均有较好的诊断效能，且其灵敏度和特异度均较好，可为MHD所致SHPT的诊断提供参考。本研究结果还显示，在MHD所致SHPT患者中，临床有效组血清可溶性Klotho蛋白含量高于临床无效组，FGF-23含量低于临床无效组，提示可溶性Klotho蛋白和FGF-23与MHD所致SHPT治疗效果也存在一定关联。ROC曲线结果显示，血清可溶性Klotho蛋白和FGF-23含量对MHD所致SHPT患者的临床疗效评估也有一定的预测价值。此外，在MHD所致SHPT患者中，无终点事件组血清可溶性Klotho蛋白含量高于终点事件组，血清FGF-23含量低于终点事件组，提示可溶性Klotho蛋白和FGF-23与MHD所致SHPT患者治疗后是否发生终点事件有密切联系。Spearman秩相关分析结果显示，MHD所致SHPT患者发生血管钙化与血清可溶性Klotho蛋白含量呈负相关，与血清FGF-23含量呈正相关。这是因为Klotho蛋白是FGF-23信号转导通路的关键点，较低水平的Klotho蛋白可影响机体血管内皮细胞功能，甚至导致其衰老及凋亡，从而增加患者发生动脉硬化的可能性，最终导致终点事件发生[25-27]。

综上，MHD所致SHPT患者血清可溶性Klotho蛋白表达下调，而FGF-23表达上调；在MHD患者中，两者对SHPT诊断及疗效评估均有一定的效能，且与血管钙化的发生密切相关。