上调微小RNA-520a对胃癌细胞恶性生物学行为和放射增敏性的影响及相关机制▲

杨 慧 李相勇

(中国人民解放军联勤保障部队第九○四医院血液肿瘤科二区，江苏省无锡市 214000，电子邮箱：bhpbnl@163.com)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，多发于50岁以上人群，且男性患病率略高于女性[1]。但随着饮食结构变化、工作压力增加、幽门螺旋杆菌感染、摄入过多食盐以及遗传等因素的影响，发病人群呈年轻化趋势[2]。胃癌早期患者无明显症状，或出现类似胃慢性疾病症状，如嗳气、上腹不适等非特异性症状，容易被忽视；随着疾病的进展可出现上腹痛、体重下降等；晚期则出现消瘦、贫血、厌食等症状；在病程终末期时，患者会表现为恶病质等肿瘤并发症[3-4]。放疗是临床上治疗癌症的常用手段之一，但是胃癌细胞对放射线不敏感，导致放疗的治疗效果不理想，因此，如何提升胃癌细胞放射敏感性成为许多学者的研究方向。miRNA是一组在转录后水平调控多个基因表达的非编码小RNA，其表达失调与众多肿瘤的发生和发展相关，在胃癌组织中也存在具有癌基因或抑癌基因功能的miRNA[5]。研究发现，微小RNA-520a(microRNA-520a,miR-520a)在乳腺癌中表达上调并发挥抑癌基因功能[6]，但miR-520a在胃癌中的表达情况鲜见研究报告。本研究探究上调miR-520a对胃癌细胞放射增敏性的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 胃癌MGC-803细胞株购于上海澳音生物科技有限公司(批号：CBP60485)。RPMI 1640培养基购于艾美捷科技有限公司(批号：67685TT)；Transwell小室购于上海生博生物医药科技有限公司(型号：AZE189217)；T7RNAi反转录试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司(批号：SV30010)；蛋白缓冲液购于上海振誉生物科技有限公司(批号：AR1112)。Janus激酶3(Janus kinase 3,JAK3)、信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、磷酸化JAK3(phosphorylated JAK3,p-JAK3)、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)抗体购于上海科敏生物科技有限公司(批号：SH3004201、BJ-S963932、YP0756、ARG57812)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：复苏胃癌MGC-803细胞后用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，并放置于含有5% CO2的37℃恒温箱中，当细胞密度长至80%～90%时，使用胰蛋白酶消化传代进行后续实验。

1.2.2 细胞转染：取对数生长期的胃癌MGC-803细胞，制备成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，放置于6孔细胞培养板，每孔100 μL细胞悬液。将细胞分为空白组、下调组、上调组， 每组设置2个复孔。当细胞生长至对数生长期时，空白组、下调组、上调组分别加入常规细胞培养液、p-Genesil(上海研生实业有限公司)与Lipofectamine 2000试剂(广州济恒医药科技有限公司)、p-Genesil-miR-520a(深圳子科生物科技有限公司)与Lipofectamine 2000试剂，2 mL/孔，转染48 h。

1.2.3 鉴定miR-520a转染情况：转染48 h后，收集细胞，采用实时荧光PCR法鉴定miR-520a转染情况。采用TRIzol法提取细胞的RNA，并检测其纯度和浓度，应用T7RNAi反转录试剂盒进行反转录反应，合成cDNA。使用Primer 5.0软件设计引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成。miR-520a上游引物为5′-GGGGAAAGTGCTTCCCTTT-3′，下游引物为5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物为5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3′，下游引物为5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。采用PCR法进行扩增，根据PCR试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]说明书配置反应体系。反应条件设置为95℃变性5 min后，95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40个循环。采用2-ΔΔCT算法计算miR-520a相对表达量。实验重复5次。

1.2.4 检测细胞增殖、凋亡情况：(1)采用四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖率。收集转染48 h后处于对数生长期的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化后将其制成细胞悬液，按2×103个/孔的浓度将细胞接种于96孔板，每组设3个复孔，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养。分别培养24 h、48 h、72 h后于每孔加入20 μL四甲基偶氮唑盐，避光孵育4 h，弃去培养液，每孔加入150 μg二甲基亚砜后于摇床上低速震荡10 min，使用酶标仪(山东莱恩德智能科技有限公司)测定450 nm波长下每孔的吸光度值，细胞增殖率=(细胞组吸光度值/空白孔吸光度值-1)×100%。(2)采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP 缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)法检测细胞凋亡情况。收集转染48 h后处于对数生长期的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化后将其制成细胞悬液，使用TUNEL法检测细胞凋亡。将细胞浸洗、固定、封闭后，滴加显色液进行标记，复染细胞核出现蓝色荧光(阴性细胞)或绿色荧光(阳性细胞)，使用荧光显微镜观察细胞凋亡情况，细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。实验重复5次。

1.2.5 检测细胞迁移、侵袭情况：(1)采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。收集各组转染48 h后处于对数生长期的细胞，将细胞接种至24孔板，待细胞增长到80%时，使用100 μL的枪头,垂直划3条直线，使用磷酸缓冲盐溶液清洗2～3次后加入含0.5%胎牛血清的RPMI-1640培养基，24 h后于倒置显微镜下观察各组细胞的迁移数量。(2)采用Transwell小室检测细胞侵袭能力。收集每组转染48 h后处于对数生长期的细胞，使用胰酶消化细胞后，用磷酸缓冲盐溶液清洗1～2次，采用10 g/L的牛血清白蛋白重悬细胞并将细胞密度调整至1×105个/mL，在Transwell小室中加入150 μL细胞悬液，将细胞悬液放置Transwell小室的上室，下室接种含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基。培养24 h后计数进入下室的细胞量，即使用乙醇固定下室细胞5 min，再使用结晶紫溶液染色，用外科尖刀片将细胞擦拭，放在玻片上用中性树胶片长期保存，倒置显微镜下计数并拍照，观察细胞侵袭状况，随机选取3个不同视野计数并取平均值。实验重复5次。

1.2.6 放射增敏作用评价[7]：各组细胞经转染48 h后，对各组转染细胞进行射线照射(srt100放疗剂量仪，北京康科达有限公司)，照射培养皿覆盖有机玻璃板2 cm，源皮距100 cm，剂量率为3.2 Gy/min，总剂量为4.0 Gy。对细胞浓度进行调整之后静置培养，2周后使用1%固定液固定0.5 h，镜下计数≥50个细胞。集落形成率(%)=培养皿中的集落数/细胞培养皿中的细胞接种数×100%。细胞存活分数(survival fraction，SF)=某剂量照射后的培养皿内的集落数/(该剂量的接种数×集落形成率)；根据多靶单机模型计算各组平均致死量(D0)、2 Gy剂量下对应的SF值(SF2)和放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)；SER=其他组的D0/空白组D0。实验重复5次。

1.2.7 检测JAK3/STAT3信号通路蛋白表达水平：采用蛋白免疫印迹法检测JAK3/STAT3信号通路蛋白表达量。各组细胞转染48 h后取生长至对数期的细胞，加入细胞裂解液提取各组细胞蛋白并使用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，制备电泳液，上样50 μg蛋白后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转至聚偏二氟乙烯膜，加入10%脱脂奶粉，25℃条件下封闭1 h，一抗(1 ∶1 000)4℃ 孵育过夜，TBST洗膜3次，5 min/次，二抗(1 ∶4 000)室温孵育1 h，洗膜3次，5 min/次，将ECL发光剂中A液和B液按照1 ∶1混合后滴加至聚偏二氟乙烯膜，于暗室曝光后，以β-肌动蛋白为内参蛋白，使用ImageQuantTMLAS 4000显影仪扫描条带，用ImageJ软件分析蛋白条带光密度。实验重复5次。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组样本间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞miR-520a转染情况 转染48 h后，上调组细胞的miR-520a相对表达量高于空白组，下调组miR-520a相对表达量低于空白组及上调组(均P<0.05)。见表1。

表1 转染后3组细胞miR-520a相对表达量的比较(x±s)

2.2 3组细胞增殖和凋亡情况 稳定转染24 h、48 h、72 h后，上调组细胞增殖率低于空白组及下调组，下调组细胞增殖率高于空白组；转染72 h后，上调组及下调组细胞凋亡率均高于空白组，且上调组高于下调组(均P<0.05)。见表2。

表2 3组细胞增殖和凋亡情况的比较(x±s，%)

2.3 3组细胞迁移和侵袭情况 上调组细胞迁移、侵袭数少于空白组及下调组，但下调组细胞迁移、侵袭数多于空白组(均P<0.05)。见表3、图1和图2。

表3 3组细胞迁移和侵袭情况的比较(x±s，个)

图1 各组细胞迁移能力的情况(×400)

图2 各组细胞侵袭能力的情况(结晶紫染色，×400)

2.4 各组细胞放射增敏情况 集落形成实验结果显示，上调miR-520a水平后胃癌细胞集落数减少，提示其可增加放射增敏作用，见图3。在放射学参数方面，上调组SF2值、D0值和SER大于空白组及下调组，下调组SF2值、D0值和SER小于空白组(均P<0.05)。见表4。

图3 各组细胞集落形成情况(吉姆萨染色，×200)

表4 3组细胞放射生物学参数的比较(x±s)

2.5 3组细胞JAK3/STAT3信号通路蛋白表达情况 上调组JAK3、STAT3、p-JAK3、p-STAT3蛋白相对表达量低于空白组及下调组，下调组JAK3、STAT3、p-JAK3、p-STAT3蛋白相对表达量高于空白组(均P<0.05)。见表5、图4。

表5 3组细胞JAK3/STAT3信号通路蛋白相对表达量的比较(x±s)

图4 3组细胞JAK3/STAT3信号通路蛋白表达情况

3 讨 论

胃癌具有较高的病死率，了解胃癌发生和发展的分子机制可为临床制定新的治疗方法提供客观依据[8]。有学者发现，一些miRNA在胃癌组织中异常表达，其参与调节胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭过程[9-10]。检测miRNA在胃癌患者组织、血液、粪便中的表达情况，对胃癌的诊断、疗效评估及预后判断有重要的价值[11]。miR-520a属于人类miR-520家族，该家族定位于人类19号及X染色体，并参与干细胞胚胎的调控。有研究显示，miR-520a在食管鳞癌组织中呈过度表达，具有抑癌基因的功能，且miR-520a可通过靶向STAT3等基因，从而在肺癌、肝癌、乳腺癌、血液系统肿瘤中发挥抑制肿瘤生长、促进凋亡、增加放射敏感等作用[12]。还有研究表明，miR-520a在结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管鳞癌等细胞中特异性表达，且参与肿瘤的发生和发展[13-14]。谢德玲等[14]的研究显示，miR-520a-3p在卵巢癌细胞中呈低表达，上调miR-520a-3p表达后卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力显著降低。刘波等[15]研究发现，下调miR-520b可抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，上调miR-520a表达后，胃癌MGC-803细胞增殖率降低、凋亡率升高，细胞迁移和侵袭数量减少。这说明上调胃癌MGC-803细胞中miR-520a的表达，能够有效抑制细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。

大多数肿瘤细胞均存在一定的放射耐受现象，临床研究显示，放疗后放射野内的肿瘤仍可能会复发[16]。胃癌的主要病理类型为腺癌，其对放疗相对不敏感，但胃周围邻近的重要器官等对放射耐受性较低，易造成放射损伤[17]。若单靠加大放射剂量以取得良好的放疗效果对机体损伤较大，如何优化放射增敏方法，提高胃癌细胞对放射的敏感性是提高放疗疗效的关键。吴越菲等[18]研究发现，上调miR-520a可增强胃癌细胞的放疗敏感性。禹玺等[19]也发现，上调miR-520a-3p可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、促进细胞凋亡，增加细胞对紫杉醇敏感性。本研究结果也显示，上调miR-520a表达后，胃癌MGC-803细胞的集落数减少，放射敏感性参数D0、SF2和SER均升高，说明上调miR-520a表达能够提高胃癌MGC-803细胞的放射敏感性，具有一定的放射增敏作用。

JAK3/STAT3信号通路是众多细胞因子信号传导的共同途径，JAK3/STAT3的表达变化与细胞增殖、分化、凋亡、炎症以及免疫调节等许多重要的生物学过程密切相关。研究显示，JAK3/STAT3可通过负调节相关因子影响其他信号通路，JAK3/STAT3信号通路过度活化，可导致靶细胞的生物学功能异常活跃，进而对机体造成严重损伤[20-21]。有研究显示，参芪扶正注射液可通过抑制STAT3通路进而抑制人胃癌细胞SGC7901增殖[22]。还有研究显示，STAT3磷酸化后可介导肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，而C-Jun氨基末端激酶3可以使STAT3发生磷酸化，抑制C-Jun氨基末端激酶3活性后，可以抑制STAT3核转位和肿瘤形成[22-23]。本研究结果显示，上调miR-520a后，胃癌MGC-803细胞的JAK3、STAT3、p-JAK3、p-STAT3蛋白表达均下降，说明上调miR-520a可使JAK3/STAT3信号通路激活受到抑制，进而抑制细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡。

综上所述，上调miR-520a表达水平可以抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡，并可增强细胞的放射增敏性，其可能通过影响JAK3/STAT3信号通路的表达发挥作用。