舒筋活血汤对腰椎间盘突出大鼠症状和髓核炎症的影响及潜在作用机制▲

李 祥 丘志河 谢卫勇 黄 刚 闵水平 王安森

(广东省深圳市龙岗区骨科医院1 骨科，2 康复科，深圳市 518116，电子邮箱：xpj764@163.com)

腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation,LDH)由椎间盘髓核或纤维环移位超过椎间盘间隙引起[1-2]，是坐骨神经痛的最常见原因。据调查，腰背痛患者的LDH发生率为15%～45%，全球每年为LDH支付的医疗费用达2 630万美元，给社会造成了严重的经济负担[3]。因此，寻找一种成本低、效益高的治疗方法十分重要。舒筋活血汤具有活血化瘀、行气止痛的功效，可减少炎症导致的组织粘连，减轻组织损伤，促使淤血消散，有效缓解急性踝关节扭伤患者的疼痛[4]。环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)是一种在组织损伤部位释放的诱导型酶，正常生理状态下在多数组织中的表达量很低，但受到生长因子、细胞因子等刺激后则会迅速释放，从而激发炎症反应[5]。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)在COX2作用下的代谢产物，因此，PGE2水平通常作为局部COX2活性的评价指标[6]。COX2被认为是调节免疫应答过程中PGE2产生的关键因素[7]。同时，PGE2和COX2之间存在一个正反馈环，PGE2的积累可能在一定条件下诱导COX2的高表达[8]。磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是膜磷脂中催化脂肪酸水解释放AA的超家族酶，是前列腺素合成的限速酶，也是许多炎症过程的上游调节因子[9]。研究表明，抑制PLA2表达可改善LDH大鼠的神经根疼痛和炎症反应[10]。因此本研究通过建立LDH大鼠模型，探讨舒筋活血汤对LDH大鼠症状及髓核炎症的影响，并基于PLA2活性、COX2/PGE2通路探讨舒筋活血汤在LDH中的作用机制，旨在为LDH的临床治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 无特定病原体级雄性SD大鼠95只，6周龄，体质量(200±20)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号为SCXK(湘)2009-0004。所有动物均严格按照动物饲养规则喂养，保持适宜的温度和湿度。

1.2 药品和试剂 舒筋活血汤：丹参、红花各12 g，羌活、防风、荆芥、独活、当归各10 g，续断、青皮、牛膝、五加皮各6 g，杜仲、枳壳各4 g；煎煮为汤药，药材选自本院中药房的标准中药材。吲哚美辛胶囊(苏州第三制药厂有限责任公司，25 mg/粒，批号：190509)；兔抗鼠PLA2、COX2、PGE2、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1β抗体(英国Abcam公司，货号：ab211573、ab188183、ab188761、ab215188、ab197447)；羊抗兔IgG(EnVision)二抗(美国CST公司，货号：7074P2)；TRIzol试剂(美国Invitrogen公司，货号：15596026)；反转录试剂盒(大连TaKaRa公司，货号：RR036A)；SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(北京智杰方远科技有限公司，货号：RR820A)；二喹啉甲酸试剂盒(美国赛默飞公司，货号：A53225)；考马斯亮蓝试剂盒(上海康朗生物科技有限公司，货号：KL-D3297)；注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂，批号：A100809310)。

1.3 实验设备 GIS-500凝胶成像仪(上海艾研生物科技有限公司，货号：1708195)；高速离心机(北京医用离心机厂，型号：LG10-2.4A)；光学显微镜(济南欧莱博电子商务有限公司，货号：CX43)；电泳仪、电转化仪(北京君意生物科技有限公司，货号：JY-SCZ2+、ZY5)。PHSJ-5T型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

1.4 LDH大鼠模型的构建 95只SD雄性大鼠适应性喂养1周。采用随机数字表法抽取15只大鼠作为对照组，正常给予普通饲料喂养，其余大鼠用于造模。造模方法：腹腔注射1%戊巴比妥钠(剂量0.4 mL/100 g)进行麻醉，麻醉成功后固定大鼠四肢，用手术剪剃除大鼠背部体毛，75%酒精消毒大鼠背部，铺无菌单，用橡皮筋扎紧大鼠尾部，在无菌条件下取出每只大鼠第3、4尾椎间盘的髓核，从而造成尾椎间盘破裂形态，并将一根无菌“L”形不锈钢柱(直径约0.4 mm，长度4 mm)插入椎间孔，对背根神经节造成稳定的压迫，将髓核置于生理盐水中备用。最后进行椎间盘的埋植，使用75%酒精常规消毒背部，以后背正中L5棘突为中心，作长约2 cm的切口，逐层切开皮肤、肌肉，将髓核植入L5和L6间的神经根，随后逐层缝合，肌肉注射青霉素钠80万U，伤口处涂抹红霉素软膏[11]。剔除死亡的5只大鼠，共成功造模75只LDH大鼠。

1.5 实验动物分组及给药方法 将LDH大鼠随机分成5组，包括模型组、吲哚美辛组、低剂量舒筋活血汤组、中剂量舒筋活血汤组、高剂量舒筋活血汤组，每组15只。于造模成功后第1天开始，按7.5 mg/kg的剂量[12]给予吲哚美辛组大鼠灌胃吲哚美辛悬液，1次/d，持续28 d。舒筋活血汤低中高剂量均按照人体和大鼠体表面积换算公式进行计算[13]：大鼠与成人体表面积的折算系数为6.3，舒筋活血汤药材总质量为106 g，按体重70 kg成人每日1付为标准，则大鼠每日给药剂量为9.54 g/kg，因此设置舒筋活血汤低、中、高剂量为9.54 g/kg、19.08 g/kg、38.16 g/kg，均于造模成功后第1天开始分别早晚灌胃给药一次，持续给药28 d。对照组和模型组给予灌胃3 mL生理盐水，持续28 d。末次给药结束后，观察大鼠一般情况。

1.6 PLA2活性检测 造模后第7、14、28天，每组分别取5只大鼠的移植髓核样本(对照组同期取相同位置髓核)，60℃水浴30 min，冷却后置于-80℃冰箱备用。取2只50 mL烧杯分别作为测定管和对照管，对照管加入底物缓冲液8 mL、15 mmol/L乙二胺四乙酸1.1 mL、髓核样本0.4 mL；测定管加入底物缓冲液8 mL、0.5 mmol/L CaCl20.2 mL、髓核样本0.4 mL。37℃水浴后，对照管加入0.5 mmol/L CaCl20.2 mL，测定管加入15 mmol/L乙二胺四乙酸1.1 mL。混匀后用高灵敏度pH计分别测量两管的pH值，用微量吸枪吸取新标定的稀盐酸(0.004 mol/L)将对照管的pH值滴定至测定管的pH值，记录消耗的稀盐酸体积(V)。一个PLA2活性单位是指37℃下每分钟每毫升样本反应消耗1 nmol盐酸，PLA活性(U)=V×ρ×106×2.5/t，V、ρ分别是所消耗盐酸的体积(mL)和浓度(mol/L)，t为反应时间(min)[11]。

1.7 荧光定量PCR法检测大鼠神经根部组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达水平 造模结束28 d后，每组选取剩余的5只大鼠，处死后取L5～L6棘突处神经根组织约100 mg，放入研磨器中，加入2 mL磷酸盐缓冲液，-4℃下1 000 r/min离心10 min取上清。按照TRIzol法提取血清总RNA，根据反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应。反应体系：2×SYBR Mix 10 μL，dH2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃ 2 min，40个循环，72℃延伸10 min。引物由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参，采用2-ΔΔCt方法计算PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA的相对表达水平。

表1 引物序列

1.8 蛋白免疫印迹法检测大鼠神经根部中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β蛋白相对表达水平 造模结束28 d后，每组选取剩余的5只大鼠，取L5～L6棘突处神经根组织约100 mg，加入适量冷蛋白裂解液，4℃下12 000 r/min离心20 min后取上清液，采用二喹啉甲酸试剂盒进行蛋白定量。取适量蛋白上样，于10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，分离的蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜。5%脱脂奶封闭2 h，加入PLA2(1 ∶1 000)、COX2(1 ∶1 000)、PGE2(1 ∶1 000)、TNF-α(1 ∶5 000)、IL-1β(1 ∶2 500)单克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，5 min/次。加入羊抗兔IgG二抗(1 ∶15 000)，室温下孵育2 h，TBST清洗3次(10 min/次)后电化学发光法显色，使用凝胶成像仪观察各组蛋白表达情况。采用ImageJ软件对蛋白条带进行分析，并计算目的条带与内参β-actin的灰度值。

1.9 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，方差齐时多组间比较采用方差分析，组间进一步比较采用SNK-q检验；方差不齐时多组间比较采用Shapiro-Wilk检验，Nemenyi法进行多重比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠的一般状态 对照组大鼠饮食正常，精力充沛，步态正常；模型组大鼠活动减少，明显跛行，或伴对侧足趾异常等症状；吲哚美辛组大鼠饮食及排泄均正常，活动较多，与对照组相似；舒筋活血汤各剂量组大鼠较模型组症状减轻，步态基本正常，饮食逐渐恢复，剂量越高状态越好。

2.2 各组大鼠髓核组织中PLA2活性的比较 与对照组相比，各时间点模型组大鼠PLA2活性均增强(均P<0.05)。与模型组相比，各时间点吲哚美辛组及低、中、高剂量舒筋活血汤组大鼠的PLA2活性均降低(均P<0.05)。与吲哚美辛组相比，低剂量舒筋活血汤组大鼠的PLA2活性仍较高(P<0.05)，但中、高剂量舒筋活血汤组大鼠PLA2活性水平差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠髓核组织中PLA2活性的比较(x±s，U)

2.3 各组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达水平的比较 与对照组相比，模型组神经根组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达水平均升高(均P<0.05)。与模型组相比，吲哚美辛组及中、高剂量舒筋活血汤组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达水平均降低(均P<0.05)。与吲哚美辛组相比，低剂量舒筋活血汤组大鼠神经根组织PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达水平以及中剂量舒筋活血汤组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达水平均升高(均P<0.05)，但高剂量舒筋活血汤组上述指标差异无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.4 各组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白相对表达水平的比较 与对照组相比，模型组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白水平均升高(均P<0.05)。与模型组相比，吲哚美辛组及中、高剂量舒筋活血汤组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白表达水平均降低(均P<0.05)。与吲哚美辛组相比，低剂量舒筋活血汤组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、TNF-α、IL-1β蛋白水平以及中剂量舒筋活血汤组大鼠神经根组织PLA2、COX2、IL-1β蛋白水平均升高(均P<0.05)，但高剂量舒筋活血汤组上述蛋白水平差异无统计学意义(均P>0.05)。见表4、图1。

表4 各组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白相对表达水平的比较(x±s)

图1 各组大鼠神经根组织中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白的表达水平

3 讨 论

LDH是脊柱外科的常见病和多发病，是引起下腰痛和腰腿痛的最常见原因。椎间盘由髓核和外纤维环组成，中央髓核是分泌胶原蛋白的部位，含有大量蛋白多糖，这些蛋白多糖有助于保持髓核水分，产生静水压力，从而抵抗脊柱的轴向压缩[14]。在LDH患者中，由于纤维环突出甚至破裂，导致髓核挤出，髓核与椎间盘间隙的连续性完全丧失。另外，已有研究证实炎性反应与LDH神经痛密切相关，椎间盘内容物挤出后会诱发免疫反应[15]。当髓核组织被挤出硬膜外间隙时，血管内皮细胞的形态变化会引发血管通透性增大、血管扩张、免疫细胞黏附和迁移，导致该部位的炎症细胞因子水平升高[15]。

中医认为，LDH主要由风寒湿痹淤血引起。而舒筋活血汤中，羌活可发汗解表，散风寒除湿；荆芥祛风，消瘀血；防风治疗骨节痹痛；独活治颈环不灵，腿足酸重麻木；牛膝除湿痹痿，强健筋骨；杜仲补肝肾，壮筋骨，治腰痛、足膝无力；当归具有补血活血、生血补心之效；青皮能攻气滞，平肝止痛；续断有助于接骨续筋，对于肝肾不足引起的腰痛、脚弱具有治疗作用；红花消瘀热；枳壳行气止痛，宽中下气；五加皮祛痛风痹。依照中医辨证理论，舒筋汤可灵活加减，屈伸疼痛者可加伸筋草[16]。沈骏等[17]应用自拟腰痹舒筋汤治疗LDH患者取得了良好效果。本研究中LDH大鼠活动减少，明显跛行，或伴对侧足趾异常等症状，经舒筋活血汤治疗后，症状逐渐好转。

PLA2在炎症性疾病中具有显著的生物学效应[18]。本研究结果显示，造模后第7、14、28天，模型组大鼠髓核中的PLA2活性、神经根组织中PLA2蛋白和mRNA的表达均较对照组升高，而各剂量舒筋活血汤组大鼠PLA2活性、中剂量和高剂量舒筋活血汤组神经根组织中PLA2蛋白和mRNA的表达均较模型组降低(均P<0.05)。这提示PLA2在LDH的发病中发挥作用，而舒筋活血汤可降低LDH大鼠局部病灶的炎症水平。

LDH发病时诱发的炎症反应被认为是一种重要的疼痛机制，有研究显示，在单核细胞浸润之前，已有炎性细胞因子存在于挤出的髓核组织中[19]。有学者在对健康牛进行椎间盘髓核植入后发现，肿胀的椎间盘在28 d内产生了高水平的IL-6和PGE2，而封闭的椎间盘则没有高水平的IL-6和PGE2表达[19]，表明椎间盘组织膨出可引起神经根炎症，这是导致LDH疼痛的关键因素。事实上，突出的髓核组织中存在多种炎症因子，单核细胞浸润、巨噬细胞成熟和挤压组织的再吸收会诱导IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2释放[20]。研究显示，PLA2是膜磷脂代谢为AA的关键酶，AA又是COX2合成PGE2的主要底物，而PGE2是一种炎症因子，可以导致神经炎症和疼痛[6，9]。因此，探究COX2、PGE2及其他炎症因子水平的变化，对揭示LDH的致病机制具有重要作用。本研究结果显示，与模型组相比，中、高剂量舒筋活血汤组大鼠神经根组织中COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白表达水平均降低(均P<0.05)，这提示舒筋活血汤可能通过抑制COX2/PGE2通路，降低LDH大鼠体内的炎症水平。

综上所述，高剂量(38.16 g/kg)的舒筋活血汤可能通过抑制PLA2活性和COX2/PGE2通路的表达，减轻LDH大鼠髓核内炎症水平，从而缓解LDH的症状。但本研究未对髓核组织进行免疫组化或病理学观察，存在一定的不足，有待后续深入研究。