蛇床子素调控circ_0084043/miR-338-3p对高糖诱导的心肌细胞损伤的影响

袁雯 杨昕宇 杨华

糖尿病性心肌病属于糖尿病并发症之一，是指糖尿病引起的一种心肌病变，可诱发心肌性坏死进而引起心力衰竭、心源性休克等最终造成患者死亡，氧化应激是促使糖尿病并发症发生的重要原因之一，同时蛋白与脂质过氧化等诱导的心肌细胞凋亡是造成糖尿病性心肌病的重要原因[1]。已有研究报道指出部分中药具有抗炎、抗氧化等作用，还可促进高糖诱导的心肌细胞生长及抑制炎性因子相关基因的表达[2]。蛇床子素是天然植物蛇床子萃取的单体，其具有抗炎、调节免疫等作用外，还可抑制炎性反应而减轻大鼠心脏缺血再灌注损伤[3]。但蛇床子素与糖尿病性心肌病相关报道相对较少。环状RNA(circRNA)在糖尿病中表达异常，并可能参与糖尿病并发症形成过程，已有研究表明circ_0084043在糖尿病性视网膜病变中表达水平升高，并可通过充当miR-140-3p的海绵分子而促进糖尿病性视网膜病变的发展[4]。生物信息学分析显示circ_0084043与miR-338-3p存在结合位点，研究表明miR-338-3p在高糖诱导的血管内皮细胞中表达水平降低，circVEGFC通过调控miR-338-3p/HIF-1α/VEGFA轴促进高糖诱导的血管内皮细胞凋亡[5]。但circ_0084043/miR-338-3p分子轴是否可介导蛇床子素对糖尿病性心肌病的治疗过程尚未可知。因此，本研究采用高糖诱导心肌细胞H9C2建立细胞损伤模型，探讨蛇床子素是否可通过调控circ_0084043/miR-338-3p影响高糖诱导的心肌细胞增殖、凋亡及氧化应激。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 蛇床子素购自长沙上禾生物；心肌细胞H9C2购自美国ATCC；DMEM培养基购自美国Gibco；胎牛血清购自上海玉博生物；RNA提取试剂盒、逆转录、荧光定量PCR试剂购自美国Thermo Fisher；LipofectamineTM2000、凋亡检测试剂盒、MTT试剂购自北京索莱宝；MDA、SOD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠Bax、Bcl-2抗体购自美国CST；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国Abcam。

1.2 方法

1.2.1 实验分组:H9C2细胞培养于含有30 mmol/L葡萄糖的培养基内培养24 h，记为高糖组(HG组)。H9C2细胞培养于含有5.5 mmol/L葡萄糖的培养基内培养24 h，记为正常糖组(NC组)。H9C2细胞分别加入含有不同浓度(10 nmol/L、33 nmol/L、100 nmol/L)的蛇床子素与30 mmol/L葡萄糖的培养基内培养24 h，分别记为HG+蛇床子素低剂量组、HG+蛇床子素中剂量组、HG+蛇床子素高剂量组。si-NC、si-circ_0084043分别转染入H9C2细胞后加入含有30 mmol/L葡萄糖的培养基内培养24 h，分别记为HG+si-NC组、HG+si-circ_0084043组。pcDNA、pcDNA-circ_0084043分别转染入H9C2细胞后加入含有100 nmol/L蛇床子素与30 mmol/L葡萄糖的培养基内培养24 h，分别记为HG+蛇床子素高剂量+pcDNA组、HG+蛇床子素高剂量+pcDNA-circ_0084043组。

1.2.2 qRT-PCR检测细胞中circ_0084043、miR-338-3p的表达水平:根据RNA试剂盒说明书提取各组H9C2细胞总RNA，检测RNA浓度后置于-80℃冰箱内保存。采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，PCR扩增反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循环。circ_0084043以GAPDH为内参，miR-338-3p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算circ_0084043、miR-338-3p相对表达量。

1.2.3 MTT检测细胞增殖:收集各组H9C2细胞(1×105个/ml)接种于96孔板(150 μl/孔)，分别加入MTT溶液(20 μl/孔)与DMSO(150 μl/孔)，室温避光孵育5 min后检测细胞吸光度值(OD值)。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率:收集各组H9C2细胞加入预冷PBS洗涤，弃上清后将500 μl结合缓冲液加入细胞沉淀中，分别加入5 μl Annexin V-FITC与5 μl PI，振荡摇晃孵育10 min后检测细胞凋亡率。

1.2.5 检测氧化应激指标MDA、SOD的水平:采用反复冻融法裂解各组H9C2细胞，根据试剂盒说明书检测细胞中MDA、SOD的水平。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测circ_0084043与miR-338-3p的靶向关系:Circular RNA Interactome预测显示circ_0084043与miR-338-3p存在结合位点，分别构建野生型载体WT-circ_0084043与突变型载体MUT-circ_0084043，miR-NC、miR-338-3p mimics分别与WT-circ_0084043、MUT-circ_0084043共转染入H9C2细胞后继续培养24 h，收集细胞并检测荧光素酶活性。

1.2.7 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达:提取各组H9C2细胞总蛋白后检测蛋白浓度，取50 μg蛋白样品进行SDS-PAGE，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃条件下孵育一抗稀释液(1∶1 000)过夜，TBST洗涤，室温条件下孵育二抗稀释液(1∶2 000)1 h，滴加ECL，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 蛇床子素对高糖诱导的H9C2损伤的影响 与NC组比较，HG组circ_0084043的表达水平升高(P<0.05)，miR-338-3p的表达水平降低(P<0.05)，细胞活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；与HG组比较，HG+蛇床子素低剂量组、HG+蛇床子素中剂量组、HG+蛇床子素高剂量组circ_0084043的表达水平降低(P<0.05)，miR-338-3p的表达水平升高(P<0.05)，细胞活力升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且不同剂量组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表1。

图1 蛇床子素对高糖诱导的H9C2凋亡的影响;A 蛇床子素对高糖诱导的H9C2中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响;B 蛇床子素可抑制高糖诱导的H9C2凋亡

表1 不同浓度蛇床子素对高糖诱导的H9C2损伤的影响

2.2 蛇床子素对高糖诱导的H9C2氧化应激的影响 与NC组比较，HG组MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)；与HG组比较，HG+蛇床子素低剂量组、HG+蛇床子素中剂量组、HG+蛇床子素高剂量组MDA的水平降低(P<0.05)，SOD的活性升高(P<0.05)，且不同剂量组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度蛇床子素对高糖诱导的H9C2氧化应激的影响

2.3 干扰circ_0084043对高糖诱导的H9C2损伤的影响 与HG+si-NC组比较，HG+si-circ_0084043组miR-338-3p的表达升高(P<0.05)，细胞活力升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，Bax蛋白降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白升高(P<0.05)。见图2，表3。

图2 干扰circ_0084043对高糖诱导的H9C2凋亡的影响;A 干扰circ_0084043可抑制高糖诱导的H9C2凋亡;B 干扰circ_0084043对高糖诱导的H9C2中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表3 干扰circ_0084043对高糖诱导的H9C2损伤的影响

2.4 circ_0084043可逆转蛇床子素对高糖诱导的H9C2损伤的影响 与HG+蛇床子素高剂量+pcDNA组比较，HG+蛇床子素高剂量+pcDNA-circ_0084043组细胞的活力降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，MDA的水平升高(P<0.05)，SOD的活性降低(P<0.05)，Bax蛋白水平明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3，表4。

图3 circ_0084043可逆转蛇床子素对高糖诱导的H9C2凋亡的影响;A circ_0084043可逆转蛇床子素对高糖诱导的H9C2凋亡的影响;B circ_0084043可逆转蛇床子素对高糖诱导的H9C2中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

表4 circ_0084043可逆转蛇床子素对高糖诱导的H9C2损伤的影响

2.5 circ_0084043靶向miR-338-3p Circular RNA Interactome预测显示circ_0084043与miR-338-3p存在结合位点。miR-338-3p过表达可降低野生型载体WT-circ_0084043的荧光素酶活性(P<0.05)，而对突变型载体MUT-circ_0084043的荧光素酶活性无明显影响。见图4，表5。

图4 circ_0084043和miR-338-3p的互补序列

表5 双荧光素酶报告实验

3 讨论

目前糖尿病性心肌病的发病机制尚未阐明，体内持续处于高糖状态可促进炎症、氧化应激等反应的发生而促进心肌细胞凋亡，部分中药的活性成分可减轻高糖诱导的心肌细胞损伤，但其作用途径、作用靶点相关研究较少[6]。circRNA在糖尿病心肌病中表达异常，并可能作为早期诊断及治疗糖尿病心肌病的生物标记物[7]。但circRNA是否可作为中药治疗糖尿病性心肌病的潜在靶点尚未可知。

蛇床子素是从蛇床果实中提取，具有抗炎、抗癌等作用，且研究表明蛇床子素可减轻类风湿性关节炎大鼠的软骨细胞损伤[8]。蛇床子素可减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤，并可抑制ROS介导的线粒体凋亡[9]。但蛇床子素对高糖诱导的心肌细胞损伤的影响尚未可知。本研究结果显示，高糖诱导的心肌细胞活力与Bcl-2蛋白水平降低，凋亡率与Bax蛋白水平升高，与报道结果[10]相似，提示成功建立糖尿病性心肌病心肌细胞损伤模型。本研究分析显示，蛇床子素处理后高糖诱导的心肌细胞活力升高，凋亡率降低，呈剂量依赖性，提示蛇床子素可促进高糖诱导的心肌细胞增殖而抑制细胞凋亡。本研究结果显示，高糖诱导的心肌细胞中MDA的水平升高，SOD的活性降低，与报道结果[11]相似，而蛇床子素处理后高糖诱导的心肌细胞中MDA水平降低，SOD的活性升高，且呈剂量依赖性，提示蛇床子素可明显抑制高糖诱导的心肌细胞氧化应激。

本研究结果显示，高糖诱导的心肌细胞中circ_0084043的表达升高，而蛇床子素处理后高糖诱导的心肌细胞中circ_0084043的表达降低，且随着药物浓度增加而明显降低，提示蛇床子素可能通过下调circ_0084043的表达发挥作用。研究表明circ_0084043在黑素瘤中表达水平升高，并可能发挥癌基因作用[12]。本研究显示干扰circ_0084043表达后高糖诱导的心肌细胞活力升高，凋亡率降低，MDA水平降低，SOD活性升高，提示干扰circ_0084043表达可促进高糖诱导的心肌细胞增殖而抑制细胞凋亡及氧化应激。为探究circ_0084043在高糖诱导的心肌细胞损伤中的作用机制，本研究证实circ_0084043可充当miR-338-3p的海绵分子而负向调控miR-338-3p的表达。有研究表明miR-338-3p在妊娠高血压患者外周血和胎盘中的表达水平升高[13]。miR-338-3p在脂多糖诱导的人支气管上皮细胞中表达下调，circ_0038467可通过充当miR-338-3p的海绵分子而促进细胞损伤[14]。本研究显示，高糖诱导的心肌细胞中miR-338-3p的表达水平降低，蛇床子素可明显促进miR-338-3p的表达，且呈剂量依赖性，而circ_0084043过表达可通过抑制miR-338-3p的表达而明显逆转蛇床子素对高糖诱导的心肌细胞增殖、凋亡及氧化应激的作用。

综上所述，高糖诱导的心肌细胞中circ_0084043的表达水平升高，miR-338-3p的表达水平降低，蛇床子素可抑制circ_0084043的表达而促进miR-338-3p的表达，并可促进高糖诱导的心肌细胞增殖而抑制细胞凋亡及氧化应激，circ_0084043过表达可拮抗蛇床子素对高糖诱导的心肌细胞损伤的作用，本研究证实蛇床子素可通过调控circ_0084043/miR-338-3p分子轴而减轻高糖诱导的心肌细胞损伤。