HPLC法测定复方苦参注射液中5-羟甲基糠醛的含量

段秀梅　张亚锰　王鹏飞　毕小凤　海丽娜　秦文杰

【摘 要】 目的：建立复方苦参注射液中5-羟甲基糠醛（5-HMF）含量的测定方法。方法： 采用高效液相色谱法，色谱柱为Waters XSelect CSH^TMC18（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流动相为甲醇-0.05%甲酸水溶液梯度洗脱，流速为0.8 mL·min^-1，检测波长为284 nm，柱温20 ℃，进样量10 μL。结果： 5-HMF质量浓度在0.022～1.11 μg（r=0.9998）范围内质量呈良好线性关系。5-HMF平均回收率为95.6%（RSD=6.70%）（n=9）。结论：本研究方法重复性好，准确度高，可用于复方苦参注射液中5-HMF的含量测定。

【关键词】 复方苦参注射液;5-羟甲基糠醛（5-HMF）;高效液相色谱（HPLC）;含量测定

【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A  【文章编号】1007-8517（2022）05-0065-03

基金项目：国家中药标准化项目资助（ZYBZH-C-JIN-43）;国家重点研究计划项目（2017YFC1701900）。

作者简介：段秀梅（1978-），女，汉族，硕士，助理研究员，研究方向为中药新药开发及中药注射液再评价研究。E-mail：duanxiumei@zdjt.com

通信作者：海丽娜（1977-），女，回族，博士，副研究员，研究方向为中药新药开发及中药注射液再评价研究。E-mail：hailinai@zdjt.com;

秦文杰（1971-），女，汉族，博士，研究员，研究方向为中药新药开发及已上市药品深度研究。E-mail：qinwenjie@zdjt.com

Determination of 5-Hydroxymethylfurfural in Compound Kushen Injection（CKI） by HPLC

DUAN Xiumei ZHANG Yameng WANG Pengfei BI Xiaofeng HAI Lina* QIN Wenjie*

Beijing Zhendong Guangming Pharmaceutical Research Institute，Beijing 100085，China

Abstract：Objective To establish a method for the determining the content of 5-hydroxymethylfurfural in Compound Kushen Injection（CKI）. Methods High performance liquid chromatography was utilized with Waters XSelect CSH^TMC18（250 mm×4.6 mm， 5 μm） chromatographic column， and mobile phase of acetonitrile-0.05% formic acid aqueous solution was used for gradient elution at the flow rate was 0.8 mL·min^-1. The detection wavelength was 284 nm; column temperature was 20 ℃; injection volume 20 μL. Results The calibration curve of 5-hydroxymethylfurfural showed good linearity within the range of 0.02～1.11 μg·mL^-1. The average recovery of 5-HMF（n=9） was 95.6% with RSD of 6.70%. Conclusion The proposed method was accurate and reproducible enough to be used for the content determination of 5-hydroxymethylfurfural in CKI.

Key words：Compound Kusen Injection; 5-hydroxymethylfurfural; High Performance Liquid Chromatography（HPLC）; Content Determination

复方苦参注射液是由苦参和白土苓经现代科学方法精制而成的中药注射液，具有清热利湿，凉血解毒，散结止痛的功效，用于癌肿疼痛、出血^[1]。近年来，中药注射剂的用药安全性引起了越來越多人的关注。5-羟甲基糠醛（5-HMF）是葡萄糖或果糖在高温或弱酸等条件下发生脱水产生的醛类化合物^[2]，可能存在于含糖类中药注射剂中。文献报道，该化合物可能引起血栓性静脉炎^[3]、对人体的横纹肌和内脏也有损害^[4]，并具有一定程度的基因毒性^[5]。在《中国药典》2020年版中，多个含葡萄糖的注射液的品种均规定了5-HMF的限量检查。前期研究^[6]表明本品中含有葡萄糖、果糖等糖类成分，在生产和贮藏制剂时可能产生5-HMF。参考相关文献，本文建立了HPLC法测定复方苦参注射液注射液中5-HMF的含量，以控制其含量水平，降低复方苦参注射液的用药风险。F228E275-FEC3-4481-8D06-BF0C8A058502

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（型号e2695分离单元，2998 PDA检测器，厂家：Waters科技有限公司）;电子天平（型号XSE205DU，厂家：Mettler Toledo）;数控超声清洗器（型号KQ5200DE，厂家：昆山市超声仪器有限公司）。

5-HMF对照品（批号为Q042-180112，纯度：98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司）;聚山梨酯80（批号：20190502-3，南京威尔药业股份有限公司）;复方苦参注射液（批号： 20181034，20181134，20181139，20181203，20181204，201812 09，20181212，20181213，20181214，20181215，20 190404，20180405，20190406，20190407，20190408，20190409，20190410，20190412，20190413，20190 414，山西振东制药股份有限公司生产）;甲醇（色谱纯，默克两合有限公司）;其它试剂均为分析纯，水为MilliPore系统所制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用 Waters XSelect CSH^TMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱;柱温20 ℃;流动相为甲醇（A）-0.05%甲酸溶液（B）梯度洗脱，洗脱梯度见表1，流速0.8 mL·min^-1;检测波长284 nm;进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取5-HMF对照品适量，加水制成每1毫升含40 μg的溶液，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液0.5～20 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成每1毫升含约0.5 μg的5-HMF溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取复方苦参注射液适量，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取聚山梨酯80适量，照复方苦参注射液制备方法，制成每1 毫升含2.5 mg的聚山梨酯80溶液，即得。

2.3 专属性 精密吸取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，分别如图1所示。图谱显示，5-HMF峰形对称性良好（拖尾因子为1.00），理论塔板数大于5000，另在测定波长284 nm处，阴性对照溶液在5-HMF峰的相应位置，未见色谱峰，表明阴性样品无干扰，该方法可用于5-HMF的含量測定。

2.4 线性 精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液适量，稀释制得浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg·mL^-1的系列对照品溶液，滤过，分别取续滤液按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，以对照品质量浓度为横坐标x（μg·mL^-1）对峰面积y进行线性回归，计算回归方程为y=83030.77x-238.45，相关系数r为1.000，结果表明，5-HMF在0.02～1 μg·mL^-1范围内具有良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取“2.2.1”项下5-HMF对照品，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录5-HMF的峰面积。结果显示，5-HMF对照品的峰面积RSD为1.61%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取复方苦参注射液（20181034批），按“2.2.2”项下平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样，记录5-HMF峰面积，并以外标法计算其含量及其RSD值，结果显示，5-HMF的平均含量为0.26 μg·mL^-1，RSD为2.06%，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取复方苦参注射液（20181034批），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下存放，分别于0、4、8、12、18、24h后取样，按“2.1”项下色谱条件进样，记录5-HMF的峰面积并计算其RSD值。结果显示，不同时间点5-HMF峰面积RSD为2.34%，表明供试品溶液中5-HMF在24 h内稳定性良好。

2.8 回收率试验 精密量取已知5-HMF含量的复方苦参注射液（20181034批）5 mL，至10 mL量瓶中，共9份，分别按复方苦参注射液中5-HMF含量的50%、100%和150%水平添加，每个水平平行3份，加水定容至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进样，记录5-HMF的峰面积，并计算其含量及回收率，结果见表2，测得9份样品平均回收率为95.56%，RSD为6.70%，小于8.0%（根据药典中规定，含量为1 μg·g^-1时，RSD可为8.0%^[7]）。表明本方法准确度较高。

2.9 检测限与定量限 精密量取5-HMF对照品溶液适量，用水逐级稀释。按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）为3确定检测限，以信噪比（S/N）为10确定定量限，结果显示，5-HMF的检出限和定量限分别为0.07 ng·mL^-1和0.22 ng·mL^-1。

2.10 样品测定 取复方苦参注射液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录5-HMF的峰面积，并计算其含量。结果见表3。

3 讨论

根据中国药典品种葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液中5-HMF限度检查的方法，折算成葡萄糖注射液（500 mL∶25 g）中最大允许量为6.1 mg，葡萄糖氯化钠注射液（500 mL：葡萄糖25 g与氯化钠4.5 g）中最大允许量为23.9 mg^[8];本品用法与用量每次20 mL，按葡萄糖注射液折算，则本品1 mL含5-HMF不超过0.305 mg·mL^-1，本实验测定20批5-HMF的含量，均远远低于此限度。F228E275-FEC3-4481-8D06-BF0C8A058502

5-HMF作为糖降解产物，对人体具有一定的潜在危害，为保证含糖类成分的注射剂临床用药安全，建议对其进行控制^[9]。本文建立了HPLC法测定复方苦参注射液中5-HMF含量的方法，供试品无需前处理，快速简便，结果准确可靠，为复方苦参注射液的质量控制提供了依据，也为中药注射液的安全性评价提供了参考。

参考文献

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（收稿日期：2021-07-21 编辑：陶希睿）F228E275-FEC3-4481-8D06-BF0C8A058502