固定化脂肪酶TLIM催化制备低芥酸文冠果甘油酯

徐春晖，王 瑶，杜俊民

（山西中医药大学 中药与食品工程学院，山西 晋中 030619）

随着全球人口老龄化，与年龄有关的神经退行性疾病越来越普遍，阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease, AD）是老年人群中最常见的痴呆症[1]。最近的统计数据显示，全世界约有5 000万人患有阿尔茨海默症或其他类型的痴呆症，影响着全球超过3 500万人，年轻人也可能患AD。患病后会导致海马区以及大脑皮层大量淀粉样斑块沉积、神经原纤维缠结和特定脑区选择性神经元和突触丢失[2]。研究证明，神经酸能够恢复神经末稍活性，促进神经细胞生长和发育，能够明显治疗和预防阿尔茨海默病[3-4]。文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge），别名文冠木、文官果、土木瓜、木瓜、温旦革子，为无患子科（Sapindaceae）文冠果属植物文冠果的木材或枝叶，是自然界富含神经酸的植物资源[5]。文冠果油占种子仁的55%～65%，其中含有大约95%的甘油三酯，具有预防和治疗高血压、血管硬化等心血管病的作用。张东等[6]检测到文冠果油芥酸含量为 8.41%，动物试验表明大量摄入含芥酸的油脂，心脏会是主要的中毒器官，可致心肌纤维化引起心肌病变，引起动物增重迟缓，发育不良。可能会对通过文冠果油摄取神经酸的心脏病消费者不利，同时限制了文冠果油的应用。尽管还未有确切报道表明其对人体的有害作用，但为保障人群健康，更应该加以重视文冠果油的质量，并采取行动[7]。联合国粮农组织及世界卫生组织已规定油脂中的芥酸含量应低于5%。

目前人们主要通过基因育种培育低芥酸植物，达到降低芥酸的目的，这种方法耗费时间长，操作要求高，不利于工业化生产，市场上还没有出现低芥酸文冠果植物。相关文献研究表明，海甘蓝和高芥酸甘蓝型油菜油中的长碳链的芥酸主要位于甘油三酯的 Sn-1、Sn-3位，而 Sn-2位芥酸含量较低[8]。本实验选用了Sn-1,3位置专一性脂肪酶 TLIM[9]与文冠果油进行反应，脂肪酶TLIM 可把甘油骨架的 Sn-1,3位脂肪酸水解为游离脂肪酸。酶催化法具有催化效率高、反应条件温和、副反应较少、产品质量好和收率高等优点，文冠果油的酶解脱除芥酸工艺的研究还未见报道。

本文以文冠果油为原料，以芥酸含量为评价指标，采用脂肪酶TLIM对酶解工艺条件进行优化，为降低文冠果油中的芥酸含量提高一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

文冠果油实验室自行榨取。

甲醇钠溶液（0.1 mol/L）、乙酸溶液（10%体积分数）、硫酸甲醇溶液（0.1 mol/L）、正己烷、石油醚、无水乙醇、氢氧化钾、酚酞：市售分析纯；固定化脂肪酶Lipozyme TLIM：北京高瑞森科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪：美国Agilent公司；800-1离心机：惠智仪诚（北京）科技发展有限公司；85-2B数显恒温磁力搅拌器：苏州威尔实验用品有限公司。

1.3 实验方法

精确称量文冠果油，加入不同量的固定化脂肪酶TLIM和水，混匀，移入广口瓶中。不同温度条件下，反应一段时间，取出油样，使用离心机离心，取上层清液将甲酯化，利用气相色谱检测文冠果甘油酯的芥酸含量。

1.3.1 酸价的测定

水解前后的样品其酸价用冷溶剂法测定。精确称取约文冠果油5 g，溶解在50 mL石油醚和95%乙醇（体积比为1∶1）的混合溶液中，滴加0.15 mL的酚酞指示剂（10 g/L，10 g酚酞溶解在1 L95%的乙醇溶液中），用0.1 mol/L（实际浓度为0.098 mol/L）的氢氧化钾乙醇标准溶液准确中和滴定。三份试样平行滴定，一份空白对照，取滴定所用氢氧化钾标准液的平均值，结果按以下公式计算。

式中：m—称取油样的质量，mg；V—滴定所用氢氧化钾溶液的体积，mL；C—氢氧化钾溶液的实际物质的量浓度，mol/L；56.1—氢氧化钾的摩尔质量。

1.3.2 不同甲酯化方法对比

取5 μL文冠果油或最佳条件酶解后产物放置于2支试管中，分别加入5滴硫酸甲醇溶液，制备成高酸价油脂甲酯化样品（酸价大于3.0）；加入甲醇钠溶液（0.1 mol/L）制备成低酸价甲酯化样品（酸价小于3.0）。摇匀，室温反应30 min，加入 5滴乙酸溶液（10%体积分数），摇匀终止反应，加入5～10滴正己烷，摇匀，静置15 min。

1.3.3 TLIM酶添加量对芥酸含量的影响

取10 g文冠果油，加入质量分数分别为1%、3%、5%、7%、9%TLIM 酶，根据水油摩尔比为40∶1加入水，在50 ℃下，反应0.5 h。

1.3.4 温度对芥酸含量的影响

取10 g文冠果油，加入质量分数7% TLIM酶，根据水油摩尔比为40∶1加入水，分别在40、45、50、55、60 ℃下，反应0.5 h。

1.3.5 反应时间芥酸含量的影响

取10 g文冠果油，根据水油摩尔比为40∶1加入水，加入质量分数7%TLIM酶，在45 ℃下分别反应2、3、4、5、6 h。

1.3.6 水油摩尔比对芥酸含量的影响

取10 g文冠果油，加入质量分数7%TLIM酶，水油摩尔比分别控制为10∶1、20∶1、30 ∶1、40∶1、50∶1，在45 ℃下，反应5 h。

1.3.7 正交实验

根据 TLIM脂肪酶酶解条件的单因素测定结果，对酶添加量（A）、反应温度（B）、反应时间（C）、水油摩尔比（D）4个因素分别展开3个水平，进行L9(34)正交实验，具体因素及水平见表 1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.8 气相色谱测定芥酸含量的色谱条件

色谱柱：30.0 m×320 μm 毛细管，膜厚0.25 μm，流速 1 mL/min。柱箱：初始温度为180 ℃，平衡 1 min，以 20 ℃/min的速率保持4 min、运行 4 min，以 10 ℃/min的速率保持8 min、运行 15 min；检测器：加热器 250 ℃。采用面积归一化法定量。

1.4 数据分析

每个实验组设三个平行实验，数据采用Origin2018进行处理，正交设计助手专业版V3.1破解绿色版对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 水解前后酸价的比较

根据图 1文冠果油的酸价从 1.12 mgKOH/g升高到126.06 mgKOH/g。

图1 文冠果油水解反应酸价的变化Fig.1 Changes of acid value in the hydrolysis reaction of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil

2.2 不同甲酯化方法对比

混合物中的甘油三酯、甘油二酯、单甘酯都是沸点较高的油脂类物质，不容易气化，要分析脂肪酸组成和含量，需要预先进行衍生化，衍生化后的产物沸点变低，容易气化[10]。本实验采用酸法和碱法两种不同的甲酯化方法，对文冠果油进行衍生化。

根据张浩对两种甲酯化方法进行对比的结果，碱法更适合甘油三酯的衍生化（酸价大于3.0），而酸法为游离脂肪酸的衍生化的最佳方法[11]。从图2可以看出脂肪酶水解文冠果油后甘油三酯中的芥酸含量降低，游离脂肪酸中的芥酸含量升高，文冠果油的酸价从 1.12 mgKOH/g升高到126.06 mgKOH/g，说明以甘油三酯为主的文冠果油转变为以游离酸形式为主，脂肪酸存在形式发生转变，同时检测到游离酸中芥酸含量由水解前12.31%增加到水解后的17.51%，可以初步断定芥酸从甘油三酯上水解下来，变为游离芥酸。由于产品的最终形式为甘油三酯成分为主，所以本实验均采用碱法甲酯化，进行衍生化。

图2 两种甲酯化方法比较Fig.2 Comparison of two methyl esterification methods

2.3 不同TLIM酶添加量对芥酸含量的影响

在水解的过程中起着催化作用的 TLIM酶具有位置专一性，能特异性水解甘油三酯Sn-1,3位上的脂肪酸，本实验研究了不同TLIM酶添加量对酶解文冠果油芥酸含量的影响，结果见图3。

图3 TLIM酶添加量对芥酸含量的影响Fig.3 Effect of TLIM enzyme addition on erucic acid content

图3显示，芥酸含量随着加酶量的增加先缓慢降低，在TLIM酶质量分数为7%时达到最低后稳定。分析原因可能是酶主要催化剂的作用，酶添加量较低时，脂肪酶水解程度不够，当 TLIM酶质量分数为7%时，酶与文冠果油的接触已经达到饱和状态，催化反应趋于稳定。因此，最佳TLIM酶添加量是质量分数为7%。

2.4 不同酶解温度对芥酸含量的影响

在酶催化的过程中，温度的变化不仅对酶的活性有很大的影响，还会致使反应的热力学、动力学过程产生有很大的变化。实验研究了不同温度对酶解文冠果油芥酸含量的影响，结果见图4。

图4 酶解温度对芥酸含量的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on erucic acid content

图4显示，芥酸含量呈现先下降后增加的趋势。酶解温度低于 45 ℃时，随着酶解温度的增加，芥酸含量不断下降，45 ℃时芥酸含量达到最小，当温度超过 45 ℃芥酸含量逐渐上升。原因可能是 Sn-2位羟基与酶形成过度中间态所需的活化能要远高于Sn-1(3)位羟基，先增加是由于温度升高加快了反应速率，后减少便是因为酶的选择性降低，反应速率会逐渐降低，芥酸含量逐渐升高。综上考虑，最佳酶解温度为45 ℃。

2.5 不同酶解时间对芥酸含量的影响

在催化反应的过程中，反应时间与芥酸含量密切相关。本实验考察了不同反应时间对酶解文冠果油芥酸含量的影响，结果见图5。

图5 酶解时间对芥酸含量的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on erucic acid content

图5显示，随着酶解时间的增大芥酸含量逐渐升高，5 h时达到最小值，随后逐渐升高。分析原因可能是脂肪酶的水解反应和酯化反应为可逆反应[12]，随着酶解时间的增加，被水解下来的游离芥酸逐渐升高，与甘油、甘油一酯、甘油二酯发生酯化反应导致文冠果油甘油三酯上结合的芥酸含量略上升，反应平衡被打破，建立起新的平衡。因此，酶解反应时间5 h为最佳。

2.6 不同水油摩尔比对芥酸含量的影响

本实验考察了不同水油摩尔比对酶解文冠果油芥酸含量的影响，结果见图6。

图6 水油摩尔比对芥酸含量的影响Fig.6 Effects of molar ratio of water to oil on erucic acid content

由图6可知，随着水油摩尔比的增加芥酸含量逐渐降低后又升高至平稳，分析原因可能是脂肪酶的活性中心部位被一个α螺旋的“盖子”结构所覆盖，当脂肪酶作用于油水反应界面时，脂肪酶分子的构像发生变化[13]。α螺旋的“盖子”打开，催化中心与底物接触，发生催化反应。当水油摩尔比较低时，文冠果油与TLIM脂肪酶的接触少，大多数脂肪酶的活性中心没暴露出来导致反应速率低；随着水油摩尔比的增加，TLIM脂肪酶与文冠果油可以充分接触，脂肪酶活性中心充分暴露，水解速率就会加快，酶解程度升高，但位置选择性会变差。综上考虑，最佳水油摩尔比为30∶1。

2.7 正交实验结果

根据单因素实验结果，对酶添加量（A）、反应温度（B）、反应时间（C）、水油摩尔比（D）4个因素进行正交实验，结果见表2。

由表 2可知，RA＞RB＞RD＞RC可得出酶添加量是影响酶水解法降低芥酸含量的最主因素，各因素对酶水解法降低芥酸含量的影响从强到弱依次是：酶添加量＞反应温度＞水油摩尔比＞反应时间。以芥酸含量为考察指标，综合分析四个因素及三组水平得到最优条件应为A1B2C2D3：酶添加量为（质量分数）5%、反应温度45 ℃、反应时间5 h、水油摩尔比为30∶1，得到芥酸含量最低4.86%。

表2 正交实验直观表L9(34)Table 2 Intuitive Table of orthogonal experiment L9(34)

2.8 文冠果油酶解后脂肪酸组成

由表 3可知，文冠果油的主要脂肪酸为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸。图7为文冠果油酶解前后气相色谱对比图，A为文冠果油色谱图，B为最优条件下酶解产物色谱图。在固定化脂肪酶TLIM的催化水解下甘油三酯上芥酸含量从酶解前的 8.04%降低酶解后到了 4.86%，且神经酸含量保持着 1%左右（酶解后为0.98%）。确定甘油三酯1,3位上的芥酸水解为游离芥酸，导致酸价升高，脱除游离酸后可得到低芥酸文冠果油，具体脱酸工艺实验室正在研究中。

图7 文冠果油及其水解产物的气相色谱图Fig.7 Gas chromatogram of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil and its hydrolysates

表3 酶解前后文冠果油组成成分Table 3 Components of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil before and after enzymatic hydrolysis %

3 结论

利用脂肪酶对文冠果油中芥酸进行水解，在酶添加量为（质量分数）5%、反应温度45 ℃、反应时间5 h、水油摩尔比为30∶1的优化工艺条件下，文冠果油甘油三酯上芥酸含量从酶解前的8.04%降低酶解后到了4.86%，芥酸含量降低了约一半，达到了联合国粮农组织及世界卫生组织的规定，同时神经酸的含量保持在1%左右，后期通过脱除游离酸可得到合格的低芥酸文冠果油。实验初步证明了芥酸分布在文冠果油的Sn-1, 3位，固定化脂肪酶 TLIM 能定向水解文冠果油的芥酸，实验结果也为低芥酸文冠果油的开发和工艺路线制定提供了可靠的支持。