冬虫夏草耳型菌核的质量标准研究

★ 田向荣 田宗旺 朱惠林 刘彦威（.江西藏远冬虫夏草科技开发有限公司 江西 丰城00；2.中国农业大学 北京 00089；.河北工程大学 河北 邯郸 05607）

冬虫夏草为我国传统名贵中药，与人参、鹿茸一起称为“中药三宝”，并名列三宝之首，其主要药用部位在虫体部分［1-2］。由于虫体只是虫子的外形，内部包裹的是冬虫夏草菌核［3］，因此，冬虫夏草的主要药用部位为冬虫夏草虫体内部的菌核。

目前，冬虫夏草行业面临五大痛点，即价格昂贵、产品稀缺、真假难辨、采挖破坏环境和过度采挖威胁物种安全。同时，天然冬虫夏草中药产品也存在缺陷，即重金属超标问题。为此，要解决这些行业痛点和产品缺陷，最有效的方法就是直接人工培养出冬虫夏草的实际药用部位冬虫夏草菌核。

冬虫夏草耳型菌核为依据《冬虫夏草菌的一种仿生学培养方法》专利技术，成功产业化出的具有固定形态（耳型）的冬虫夏草菌核产品［4］。现对该产品的质量研究情况予以报道。

1 材料与仪器

1.1 材料

产业化生产的15批次冬虫夏草耳型菌核。冬虫夏草对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：111977-201604）、尿苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110887-201803）、鸟苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111977-201501）、腺苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110879-201703）、麦角甾醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111845-201604）。

1.2 仪器

显微镜（奥林巴斯CX31RTSF）、高效液相色谱仪（岛津LC-2030）、热循环仪（L9800）、电泳仪（JY600E）、凝胶成像分析系统（JY04S-3C）、厢式电阻炉（SX2-4-10A）。

2 方法

2.1 基原研究

权威单位鉴定后专家论证。

2.2 名称确定

专家论证。

2.3 性状研究

观察、描述。

2.4 鉴别研究

2.4.1 显微鉴别参照《中国药典》［5］通则2001。取本品适量，加温水浸泡软化处理后，用镊子夹取一小片。选取平整的薄片置载玻片上，加入甘油醋酸溶液后取盖玻片轻压铺平，置显微镜下观察。

2.4.2 薄层层析鉴别参照《中国药典》通则0502。取本品、天然冬虫夏草的虫体部分和子实体部分0.5 g分别研细（过3号筛），加甲醇20 mL，超声处理15 min，滤液作为供试品溶液。同法制备对照药材溶液。取麦角甾醇对照品加甲醇制成0.4 g/L的对照品溶液。取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚60～90℃-乙酸乙酯-甲酸（10∶3∶0.3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷20%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，在紫外光365 nm下检视。

2.4.3 DNA分子生物学鉴别参照《中国药典》通则1001。取本品0.03 g加液氮充分研磨三次，按试剂盒方法提取DNA，华大基因合成引物， PCR扩增体系：2×Taq plus master mix 12.5 μL，上下游引物0.5 μL，模板 1.2 μL，双蒸水 10.3 μL。PCR 扩增程序：预变性 94 ℃ 3 min、变性 94 ℃ 40 s、退火 54 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 50 s、35个循环，最后一个循环72℃10 min。扩增后产物经凝胶电泳，保存电泳结果。

2.5 检查

2.5.1 水分检查参照《中国药典》通则0832第二法。取本品2 g，平铺于恒重的扁形称量瓶中，厚度不超10 mm，精密称定，开盖100～105 ℃干燥5 h，盖好瓶盖移置干燥器中，放冷30 min，精密称定，至连续两次称重的差异不超过5 mg为止。根据减失的重量计算供试品水分（%）。

2.5.2 灰分检查参照《中国药典》通则2302。（1）总灰分测定法：本品粉碎过二号筛，混合均匀后，取供试品3 g，置于炽灼至恒重的坩埚中，称定重量（准确至0.01 g），缓慢加热至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600 ℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品总灰分（%）。（2）酸不溶性灰分测定法：取总灰分于坩埚中，加入稀盐酸约10 mL，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10 min，表面皿用5 mL热水冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，并洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移置同一坩埚中，干燥，炽灼至恒重。根据残渣重量，计算供试品酸不溶性灰分（%）。

2.5.3 浸出物检查参照《中国药典》通则2201中水溶性浸出物测定法中的热浸法测定。取供试品约2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加水100 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量。除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量（%）。

2.6 含量测定

2.6.1 尿苷、鸟苷和腺苷含量测定尿苷、鸟苷和腺苷含量测定参照《中国药典》通则0512。色谱条件：Ultimate AQ-C18ODS柱（4.6 mm×250 mm）；以水为流动相A，以甲醇为流动相B，柱温为35 ℃；检测波长为260 nm；进样量10 μL；理论板数按腺苷峰计算应不低于5 000。行梯度洗脱。见表1。

表1 流动相洗脱程序

对照品溶液的制备：取尿苷对照品、鸟苷对照品及腺苷对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含尿苷 8 μg、鸟苷 8 μg、腺苷 10 μg的混合溶液，即得。供试品的制备：取本品粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置带塞锥形瓶中，精密加入水25 mL，密塞，摇匀，称定重量，50 ℃水浴13 h后放冷，称量，加水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.6.2 麦角甾醇含量测定麦角甾醇含量测定参照《中国药典》通则0512。色谱条件：Ultimate AQ-C18ODS柱（4.6 mm×250 mm）；甲醇为流动相；流速1 mL/min；柱温为35 ℃；波长为283 nm；进样量10 μL；理论板数按腺苷峰计算应不低于5 000。麦角甾醇对照品溶液：取麦角甾醇对照品适量加甲醇制成浓度为40 μg/ mL的溶液作为对照品溶液。

麦角甾醇供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率180 W，频率40 kHz）1 h后放冷，称量，加甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

2.6.3 多糖含量测定多糖含量测定参照NY/T 1676-2008 食用菌中粗多糖含量的测定［6］，其中的反应条件和样品处理方式已做方法考察。对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，加水制成每1 mL含0.10 mg的溶液，即得。标准曲线的制备：取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，各加水至1.0 mL，向试管中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，迅速加入5.0 mL硫酸，密塞，混匀，室温反应30 min，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。供试品溶液制备：取本品粉末，约0.5 g，精密称定，置离心管中，用5 mL水浸润样品，缓慢加入20 mL无水乙醇，混匀后超声30 min。于4 000 r/min离心10 min，弃去上清液。不溶物加10 mL的80%乙醇溶液洗涤，4 000 r/min离心10 min，弃去上清液，不溶物加40 mL水超声（功率500 W）20 min，沸水浴2 h，冷却至室温，于4 000 r/min离心10 min，取上清，沉淀加水润洗，离心，取上清收集至100 mL容量瓶中，摇匀，定容，精密量取上清液1.0 mL，置10 mL容量瓶中加水至刻度，摇匀为供试品溶液。

测定法：精密量取供试品溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项的方法测吸光度，据标准曲线计算水葡萄糖的含量。

2.7 确定贮藏条件的稳定性研究

参照《中国药典》通则9001。稳定性影响因素试验：通过稳定性影响因素试验观察本产品受温度、湿度、光线的影响。（1）高温试验：样品敞口放置在温度（40±2）℃的隔水式恒温箱中，于0、5、10、30 d取样，按稳定性重点考察项目（性状、鉴别、水分、浸出物、含量）检测。（2）高湿试验：样品敞口放置在温度（25±2）℃，相对湿度（75±5）%，于5 d、10 d观察、取样，按稳定性重点考察项目（性状、鉴别、水分、浸出物、含量）检测。（3）强光照射试验：样品敞口放置在光照（4 500±500）lx，于5 d、10 d观察、取样，按稳定性重点考察项目（性状、鉴别、水分、浸出物、含量）检测。稳定性试验：本品采用市售包装材料包装。选择中试的三批进行加速试验和长期试验稳定性考察。加速稳定性试验条件：温度（30±2）℃，湿度（65±5）%。长期稳定性试验条件：温度（18±2）℃，湿度（60±5）%。

3 结果

3.1 基原

本品基原由中国医学科学院药用植物研究所真菌分类专家陈娟及江西中医药大学皮持衡教授主持的中医药界专家论证会确定本品为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.经浅层静止培养后的干燥菌核。全年均可采收，低温干燥。拉丁名为Cordyceps sinensis auricula。

3.2 名称

本品由专家论证会建议定名为冬虫夏草耳型菌核［7］。

3.3 性状

15份样品均呈不规则的圆形或耳形片状，直径4～10 cm，厚1～4 mm，表面淡黄色至黄褐色，质脆易断裂，断面菌肉类白色至黄褐色。气香特异，味微甜。见图1、图2。

图1 培养状态的产品

图2 干燥后的产品

3.4 鉴别

3.4.1 显微鉴别全部样品切面均由菌丝紧密交织而成。外层菌丝棕色，不易分离；内部菌丝无色，常交错成团，弯曲，直径2～10 μm，有的可见分隔，有分枝或呈结节状膨大。见图3。

图3 菌丝显微图

3.4.2 薄层层析鉴别全部供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，表明全部样品均与国家标准药材冬虫夏草的薄层层析色谱图一致，15个样品的鉴别见图4。

图4 薄层色谱图

3.4.3 聚合酶链式反应全部供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳图相应的位置上，在500～750 bp有单一DNA条带，阴性对照没有出现，表明本15个样品均为同一物种，且与国家标准对照药材冬虫夏草一致。见图5。

图5 PCR电泳图

3.5 检查

从15批样品水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物的检查数据趋势图可以看出，各项指标基本在一个水平线上上下浮动，表明15批样品检查指标基本一致，质量稳定。见表2。考虑产品贮存期，暂定本品水分不得过6.0%；总灰分不得过6.0%；酸不溶性灰分不得过4.0%。

表2 15批样品检测数据 %

3.6 含量测定

15批样品核苷和麦角甾醇含量测定基本在一条水平直线上上下浮动，多糖含量浮动较小，表明各批次之间核苷、麦角甾醇和多糖含量基本一致，质量稳定。

将15批次产品检测核苷的水提液色谱图叠放在一起进行比较，15批次样品水提液色谱图基本一致，表明各批次间物质组成基本一致，产品品质稳定。见图6。含量暂定本品按干燥品计算，含尿苷、鸟苷、腺苷总含量不得少于0.1%。

图6 15批次产品核苷检测色谱图

3.7 贮藏

3.7.1 稳定性试验样品信息稳定性考察的样品严格按照拟定的工艺规程生产。样品分两种，一种为菌核：冬虫夏草耳型菌核；另一种为菌核粉碎的细粉：冬虫夏草耳型菌核粉。每种三个不同批号进行稳定性试验。稳定性试验样品信息见表3。

表3 稳定性试验样品信息

3.7.2稳定性影响因素试验

3.7.2.1 高温对检测结果的影响冬虫夏草耳型菌核F3和冬虫夏草耳型菌核粉U3敞口在温度（40±2）℃的条件下存放，除麦角甾醇外和水分外，其它指标影响变化不大。产品在两种不同形态的样品中麦角甾醇含量都出现了相同程度的下降，水分也有所下降，试验数据表明麦角甾醇在温度（40±2）℃条件下存在一定的不稳定性。

3.7.2.2 高湿对检测结果的影响上述趋势图表明，冬虫夏草耳型菌核F3和冬虫夏草耳型菌核粉U3敞口在相对湿度（75±5）%，温度（25±2）℃的条件下存放，除水分外，其它指标影响变化不大。产品在两种不同形态的样品中水分含量均出现了明显的上升，试验数据表明两种产品形态引湿性都较强。在包装材料上要注意密封性，防止产品吸湿变性。

3.7.2.3 光照对检测结果的影响冬虫夏草耳型菌核F3和冬虫夏草耳型菌核粉U3在强光（4 500±500）lx照射下存放10 d，所考察的指标影响变化都不明显。两种形态的产品对光相对比较稳定。

3.7.3稳定性试验

3.7.3.1 加速稳定性试验6个月的加速稳定性试验（30±2）℃/（75±5）%选取6份样品，代号分别为F1、F2、F3、U1、U2和U3，图12试验结果表明：样品水分、水溶性浸出物、多糖、麦角甾醇和微生物等项目6个月基本稳定。

18个月长期稳定性试验（18±2）℃/（60±5）%RH试验结果：样品性状、鉴别、水分、水溶性浸出物、含量、微生物等项目与初始相比几乎无变化，试验数据表明冬虫夏草耳型菌核存放较为稳定。

4 讨论

全部样品均由冬虫夏草菌培养而成，定名为冬虫夏草耳型菌核，基原与冬虫夏草一致。

全部15批样品的性状、鉴别、检查指标、成份检测结果基本稳定、一致，检查指标符合国家标准，鉴别特征与国家标准药材冬虫夏草一致。检查、鉴别和检测等方法符合国家标准、药典要求，并经过方法学确认或验证。

拟定冬虫夏草耳型菌核贮藏条件为密封、阴凉干燥处。

4.1 关于冬虫夏草耳型菌核的定名

本产品为笔者的发明成果，生产企业预定名为“耳型冬虫夏草”。

2021年2月27日，丰城市人民政府及中国医疗保健国际交流促进会中药学分会组织以中国工程院院士黄璐琦为组长，有中国农业微生物学会副秘书长兼中国农业大学教授宋渊等相关6位中医药及微生物专家参加，在北京对江西藏远冬虫夏草科技开发有限公司的“耳型冬虫夏草的属性和产业化”项目进行了专家论证［8］。因本产品系通过对冬虫夏草菌进行浅层培养后，自然生长、分化为有一定形态（耳型）的菌核体，专家论证共同形成专家意见为“一是该产品系从野生冬虫夏草中分离的冬虫夏草菌（中国被毛孢）经浅层静止培养形成的菌核；二是该产品与野生冬虫夏草比较，在化学成分、生物活性等方面有较大相似性。且状态呈耳型，建议命名为‘冬虫夏草耳型菌核’”。故此确定本专利方法培养出的产品性质为菌核，产品名称定为冬虫夏草耳型菌核。

4.2 关于冬虫夏草耳型菌核的基原

本产品使用的菌种经中科院微生物所鉴定为中国被毛孢。中国科学院药用植物研究所真菌分类专家陈娟副研究员及江西省药品检验检测研究院袁桂平主任根据藏远公司的研究成果、中科院微生物所的鉴定结果和真菌分类理论进行论证，认定冬虫夏草耳型菌核的基原为线虫草科真菌冬虫夏草耳菌Ophiocordyceps sinensis（Berk.）G.H. Sung et al. var.auriculaChen et Yuan。

2021年4月27日，江西省中医药管理局和丰城市人民政府联合举办了“冬虫夏草耳型菌核中药属性及相关事宜”专家论证会，会议由江西中医药大学皮持衡教授主持，有范崔生教授等8位省内中医药专家参与［8］。与会专家论定应以现行版《中国药典》为规范，确定其基原改为：本品为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.经浅层静止培养后的干燥菌核。全年均可采收，低温干燥。拉丁名为Cordyceps sinensis auricula。

本产品从学术角度看，陈娟的论证结论是正确的，但《中国药典》的权威性不容颠覆，而其修订需有一定的法定程序和一个漫长过程，在《中国药典》修订前只能其为标准。

4.3 关于冬虫夏草耳型菌核的质量标准研究

本研究参考2020版《中国药典》，通过对冬虫夏草耳型菌核进行显微鉴别、薄层层析鉴别和聚合酶链式反应鉴别，3种方法可作为冬虫夏草耳型菌核的鉴别依据；通过对冬虫夏草耳型菌核各检查项、浸出物以及核苷类、麦角甾醇和多糖的成分测定，结果表明各批次产品质量可控，分离度好，重现性高，可作为冬虫夏草耳型菌核的质量控制标准；通过稳定性试验，初步确定温度、湿度和光照变量对产品各检查项的影响，拟定冬虫夏草耳型菌核贮藏条件。

鉴别方法、质量控制标准以及稳定性试验三者组成完整的产品质量标准研究。为冬虫夏草耳型菌核的制剂提供了质量控制依据，为后续研究的有效性和合理性提供了质量保障。